药大分析化学荧光分析法

第十一章荧光分析法

Fluorometry荧光分析法概述1基本原理2荧光定量分析方法3荧光分析技术与应用4小结5一、概述光致发光：指处于激发态的分子或原子通过发射出一定波长的光，以辐射的形式回到基态，这种能级的变化叫光致发光(辐射跃迁)。最常见的两种光致发光是荧光和磷光。荧光（Fluorescence)物质吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级回到基态时所发射出的光称为荧光。一、概述荧光分析法（Fluorometry)根据物质的荧光谱线位置及其强度鉴定物质并测定物质含量的方法称为荧光分析法。根据光源不同，荧光分析法可分为:X射线荧光法（X-rayfluorometry)原子荧光法（AtomicFluorometry)分子荧光法（MolecularFluorometry)一、概述荧光分析法与紫外-可见分光光度法的比较吸收光谱发射光谱本质一般高选择性10-5~10-7g/mL10-8~10-10g/mL灵敏度不同点分子光谱分子光谱相同点紫外可见荧光荧光分析法概述1基本原理2荧光定量分析方法3荧光分析技术与应用4小结5二、基本原理1.分子荧光光谱的产生（1）分子能级与电子能级的多重性单重态（singletstate):总自旋S=0，两个电子自旋方向相反，M=2S+1=1三重态（tripletstate):总自旋S=1，两个电子自旋方向平行，M=2S+1=3π*基态单重态激发态单重态

激发态三重态π*π*πππ二、基本原理（2）荧光的产生处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径：振动驰豫

vibrationalrelexation内部能量转换

internalconversion荧光

Fluorescence外部能量转换

externalconversion体系间跨越

intersystemcrossing磷光

Phosphorescenceν0ν2ν1ν3ν4adfbceS2*S1*S0T1a吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光荧光和磷光产生的示意图ν0ν2ν1ν3ν4ν0ν2ν1ν3ν4ν0ν4ν1ν2ν3二、基本原理2.激发光谱和发射光谱

硫酸奎宁的激发光谱(a)和发射光谱（b)（1）

激发光谱（excitationspectrum)（2）

发射光谱（emissionspectrum)二、基本原理（3）荧光光谱的特点a.斯托克斯位移（Stocksshift)：荧光发射波长总是大于激发光波长。

硫酸奎宁的激发光谱(a)和发射光谱（b)二、基本原理（3）荧光光谱的特点c.荧光光谱与激发光谱呈对称镜像关系。

蒽的激发光谱和荧光光谱（溶剂：环己烷）S0S1*ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1蒽的能级跃迁图二、基本原理3.分子结构与荧光的关系（1）荧光寿命和荧光效率a.荧光寿命（fluorescencelifetime)：指除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/2时所需的时间，常用τf表示。式中：F0，Ft为激发态时t=0和激发后时间t时的荧光强度。▲如果以ln(F0/Ft)对t作图，直线斜率即为1/τf，由此可计算出荧光寿命。二、基本原理b.荧光效率（fluorescenceefficiency)：它又称为荧光量子产率（fluorescencequantumyield)，就是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用φf表示。▲φf,max≤1二、基本原理3.分子结构与荧光的关系（2）分子结构对荧光效率的影响a.能发射荧光的物质必备的两个条件分子一定要能吸收紫外光、可见光。有较高的荧光量子效率。具有吸光结构，结构中有π→π*，n→π*，而n→π*引起是弱吸收，有时不足以发射荧光，只有分子只能够存在共轭的π→π*跃迁，也就是K带强吸收时，才可能有发生荧光。二、基本原理b.分子结构与荧光的关系长共轭结构。苯萘蒽λex=205nmλem=278nmΦf=0.11286nm321nm0.29356nm404nm0.36

结论：当π电子共轭越长，λex和λem都将长移，荧光强度（荧光效率）也会增大。二、基本原理分子的刚性和共平面。

结论：在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光强度（荧光效率）也会增大，并且荧光波长产生长移。联苯φf=0.2芴φf=1.0二、基本原理a.1-二甲胺基萘-7-磺酸钠φf=0.75b.1-二甲胺基萘-8-磺酸钠φf=0.03主要是b由于空间位阻效应使分子发生扭曲，两个苯环不能共平面，从而使荧光大大减弱。反式强荧光顺式无荧光对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一侧，由于空间位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。二、基本原理★.取代基的作用。①.给电子基团能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。例如：-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等20280~390C6H5CN苯基氰20285~245C6H5OCH3苯基醚10270~310C6H6苯18285~365C6H5OH苯酚20310~405C6H5NH2苯胺荧光相对强度荧光波长/nm分子式化合物取代基对苯荧光的影响（乙醇溶液）二、基本原理★.取代基的作用。②.吸电子基团会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。例如：-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等注意：卤素取代基会随着原子序数的增加而减少荧光效率，这可能是由于重原子效应。有荧光无荧光二、基本原理★.取代基的作用。③.对电子共轭体系作用较小的取代基对荧光的影响不明显。例如：-R、-SO3H、-NH3+等二、基本原理四、影响荧光的外界因素：1、温度：低温，φ↑。（∵T↑分子运动加快，磁撞几率↑无辐射跃迁↑，外转换能量损失↑，φ↘）原因：T↘，分子动能↘，非辐射失活↘。2、溶剂：①溶剂介电常数↑，极性↑

→*ΔE↘,λ↑，φ↑。②溶剂含重原子或溶液、溶解氧（CBr4,C2H5I等），体系间跨越↑。使φ↘，甚至熄灭。③溶剂粘度，若粘度大，φ↑，F↑（若粘度小，分子碰撞增加，非辐射跃迁增加，φ↘，F↘）

二、基本原理

3、pH的影响：

无荧光兰色荧光无荧光

pH﹤2pH7～12pH﹥13（因为-NH2为提高荧光效率的取代基，斥电子基团）4、荧光熄灭剂的影响：荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象为荧光熄灭。引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂。如卤素离子

二、基本原理5、散射光的影响：Rayleigh,Raman

瑞利光：光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方向改变，这种散射光为Rayleigh,其波长与照射光相同。

拉曼光：光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质有能量交换，散射光波长有所改变（增大或变小），这种光为拉曼光。拉曼光的波长位置与荧光波长非常接近，常影响荧光纯度二、基本原理第三节荧光定量分析一、荧光强度与浓度关系：

荧光强度F与溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的量子效率有关。荧光强度F与被测物质吸收光的强度成正比。受激后，可在各个方向发射荧光在透过光的方向不易测定F。第三节荧光定量分析F=K．(I0-I)由Beer定律：=10-Ecl则：F=K．I0（1-10-Ecl）=K．I0（1-e-2.3Ecl）将e*级数泰勒展开：有：F=K．I0[1-（1+…）]当浓度很小时，Ecl很小，当Ecl≤0.05时，级数中第二项以后可以忽略。∴F=K．I02.3ELC即：F=KC

条件：C小，使Ecl≤0.05，否则线性产生偏离。第三节荧光定量分析二、分析方法：

1.工作曲线法：C0C1C2…

①激发曲线找λ激②测F，荧光：F0F1F2

③回归④测定2.比例法：取已知量的纯净荧光物质配一标液，使浓度在线性范围内，测Fs。同样条件下测试样Fx(若空白液的荧光强度调不到0%时，应扣除空白F0。则：（F0后类似于可见紫外中A0应扣除）第四节仪器一、荧光计主要部件（与可见紫外对照）Vis.UV光源→单色器→样品池→检测器→记录荧光光源→单色器1→样品池→单色器2→检测器→记录

1.激发光源：高压Hg灯，产生线光谱365nm低压Hg灯，产生线光谱254nm（光电荧光计）氙灯（荧光分光光度计），产生连续光谱250-700nm其中300-400射线强度几乎相同。第四节仪器2.单色器：激发滤光片（第一滤光片）：在光源和样品池之间，将不需要的光滤去。荧光滤光片（第二滤光片）：在样品池与检测器之间，只让所发射荧光照射到检测器上。目前的荧光分光光度计，用光栅作单色器；光电荧光计用滤光片。3.检测器：光电倍增管4.样品池：低荧光的玻璃or石英制成，四面透光。第四节仪器二、荧光计种类：光电荧光计荧光分光光度计激发光源汞灯氙灯激发单色器第一滤光片光栅发射第二滤光片光栅