姬松茸多糖的提取工艺优化

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blazei

Murill.）又名小松菇、柏氏蘑菇、巴西蘑菇，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属。是一种大型真菌，具有浓郁杏仁香味[1]。姬松茸是夏秋发生的草地腐生菌。姬松茸的子实体粗壮，菌盖扁圆形、馒头形，直径5～10cm，表面覆有淡褐色或褐色的纤维状鳞片，中央较厚，可达10cm以上，边缘薄，有菌幕的碎片，颜色为白色；菌褶离生，较密集；菌柄圆柱状，柄基部稍膨大，长4～14cm，粗2～3cm；菌环着生菌柄的上部，膜质，白色；孢子印黑褐色，孢子暗褐色，光滑，宽椭圆形至球形，6.3～7.0×4.5～6.3μm。

姬松茸含有多糖、糖蛋白复合体、凝集素、甾醇类物质及核酸等多种提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒成分[2]。新鲜子实体含水分85%～87%。干菇中粗蛋白40%～50%，多糖类38%～45%，纤维素6%～8%，粗灰分5%～7%，粗脂肪3%～4%，干菇含VB10.3%、VB23.2%、烟酸49.2%[3]。矿质元素的组成：总灰分（干菇）P7486mg/kg，Mg528mg/kg，Ca157mg/kg，Na118mg/kg，Cu14mg/kg，B9mg/kg，Zn9mg/kg，Fe6mg/kg，Mn0.1mg/kg，与抗癌有关的极引人注目的铬含量在干菇中为28mg/kg。多糖类化合物广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，也是构成生命的四大基本物质之一。20世纪50年代发现真菌多糖具有抗癌作用，后来又发现地衣、花粉及许多植物均含有多糖类化合物，并进行分离提纯，确定了其化学结构、物理化学性质、药理作用，尤其对多糖类化合物的抗肿瘤和免疫增强作用进行深入研究。近年来国内学者对姬松茸多糖的生命活性进行了大量研究，成果包括:(1)抗肿瘤机制研究证明其可通过提高机体免疫力间接发挥抗肿瘤效果；也有通过抑制肿瘤细胞增生，进而促进肿瘤细胞凋亡的作用。国内外实验研究证明，应用从姬松茸子实体和菌丝体中提取的多糖，具有增强机体免疫力、抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡等明显的抗肿瘤作用。(2)增强机体免疫力崔红霞等[4]采用mT法检测姬松茸多糖体外与肝癌细胞Bel一7402作用48h的细胞毒作用，以及与小鼠脾细胞共培养上清对Bel一7402细胞作用48h的抑制作用，结果表明姬松茸多糖体外无直接细胞毒作用，不同浓度的小鼠脾细胞共培养上清体外对Bel一7402细胞生长均有抑制作用，其中低剂量组作用最显著，抑制率为39.65％说明姬松茸多糖可通过增强小鼠脾淋巴细胞功能，抑制Bel一7402细胞的生长。(3)保肝作用国内研究表明，姬松茸有效成分能促进慢性乙型肝炎患者肝功恢复[5]。段县平等[6，7]在姬松茸多糖对四氯化碳染毒兔肝脏的保护效应，以及其毒性反应的研究表明，一定剂量范围内的姬松茸多糖不但对动物无毒害作用，反而能提高对肝脏保护作用尤其是显著降低肝脏的谷丙转氨酶(GPT)水平。研究显示出姬松茸多糖通过刺激肝细胞DNA的合成使肝细胞增殖，同时提高抗氧化酶活性、保护肝细胞膜完整性、减少其破损，抑制血清和血浆中GPT和GOT(谷草转氨酶)活性的升高。近年来，关于姬松茸粗多糖提取方法主要有酶提法，热水浸提法[8]。前者采用加入纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等酶法进行提取，但加酶提取不仅生产成本高，同时也给产物的分离带来困难。据有关文献记载，多糖提取的影响因素主要有料液比、提取温度和提取时间[9]。本文针对热水浸提法提取姬松茸中粗多糖成分的工艺，研究了这3个因素对多糖提取率的影响，结合正交试验优化的操作方法，具有实际生产意义。2材料与方法2.1材料2.1.1原料姬松茸：购于山西农业大学食用菌中心。2.1.2试剂苯酚溶液、无水乙醇、蓝色葡聚糖、丙酮、乙醚，浓硫酸等均为分析纯，实验用水为蒸馏水。2.1.3仪器设备科伟电热恒温水浴锅（北京化玻联医疗器械有限公司）756型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）BS210S型电子天平（北京赛尔利斯天平有限公司）ThermoScientificFinnpipetteFocus移液器（芬兰雷勃Thermo）新飞BCD-248GBS/M型冰箱2.2方法2.2.1提取工艺流程60℃对姬松茸子实体干燥处理→粉碎→过40目筛→浸提→过滤→滤渣复提→合并滤液浓缩→醇沉→离心→乙醚洗涤→丙酮洗涤→2.2.2多糖含量的测定2.2.2.1原理以苯酚-硫酸为显色剂，用比色法测定姬松茸子实体中多糖含量，其中多糖类成分在浓硫酸作用下，先水解成单糖，单糖迅速脱水生产糠醛衍生物，糠醛与苯酚直接结合成橙色衍生物，该衍生物在490nm处出现最大吸收，其吸收值与糖质量浓度呈线性关系，样品测定以标准曲线来计算多糖含量[10]。2.2.2.2标准蓝色葡聚糖溶液曲线制备称取干燥后的蓝色葡聚糖(200,0000D)0.100g，加适量蒸馏水溶解，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。分别精确吸取葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、O.3、0.4、0.5、0.6mL置于25mL比色管中，加水至1.0mL，再分别加入5％苯酚溶液1.0mL和浓硫酸10.0mL，放置10min，摇匀，置于20～30℃水浴中保温15min。然后在490nm波长下测定吸光值，以葡聚糖含量(mg／mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，2.2.2.3多糖提取率的测定用葡聚糖标准品通过苯酚硫酸法[11]制备工作曲线，得到线性回归方程，同法测定样品提取液中多糖吸光度，通过回归方程计算姬松茸多糖含量粗多糖提取率(％)=2.2.3单因素实验2.2.3.1温度对多糖提取率的影响分别准确称取姬松茸样品100g，在六份样品中分别加入蒸馏水，料液比1∶30，置于水温为75、80、85、90、95、100℃的恒温水浴锅内提取3h。6份样品分别提取1次，纱布过滤后取滤液。在滤液中加入1倍体积的95%的乙醇，经离心处理后分别加入乙醚和丙酮进行洗涤，干燥后称量粗多糖质量。2.2.3.2浸提时间对多糖提取率的影响分别准确称取姬松茸样品100g，在七份样品中分别加入蒸馏水，料液比1∶30，置于水温为90℃的恒温水浴锅内分别提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h。72.2.3.3料液比对多糖提取率的影响分别准确称取姬松茸样品100g，在六份样品中分别加入蒸馏水，料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。置于水温为90℃2.2.4多糖提取条件优化在单因素试验的基础上，以浸提温度、时间、料液比为因素采用三因素三水平正交试验（L933）对提取条件进行优化，因素水平表见表一[12]。表1因素水平表Table1Thetableofactorsandlevels水平因素A温度(℃)B时间(h)C料液比19021∶202952.51∶30310031∶403结果与分析3.1多糖标准曲线的绘制3.1.1多糖含量的测定运用苯酚硫酸法，称取少量姬松茸粉溶解到水中，加入苯酚和硫酸，用分光光度计测量吸光值，根据标准曲线算出多糖含量为39%。3.2不同条件对姬松茸多糖提取率的影响3.2.1浸提温度对多糖提取率的影响浸提温度对姬松茸中多糖的提取的影响见图一：Figure1Effectoftemperatureonextractionyield由图1可见，随着温度的升高，多糖提取率逐渐增大。在90℃之后多糖提取率有明显提高，说明热水浸提温度对多糖提取工艺有很大影响，可能伴随温度的提高，原料溶胀度增加，导致多糖溶出率增加。从图中可看出在90℃~95℃之间有一定增幅，但是95℃~100℃3.2.2浸提时间对多糖提取率的影响浸提时间对姬松茸中多糖的提取的影响见图二Figure2Effectoftimeonextractionyield由图2可见，在3h范围内，随着浸提时间的延长，多糖提取率在逐渐增大，在3h多糖提取率达到最大，后随时间的延长而下降。这可能是因为浸提时间过长,姬松茸中其他物质被浸提出来,使浸提液变稠,不利于后续乙醇沉淀时多糖的析出,从而影响提取率。长时间浸提对多糖的物理和化学性质也会产生不良影响,可能引起糖结构的变化和破坏,甚至使其中的五碳糖或六碳糖裂解,导致提取率的下降。因此浸提时间以3h为宜。3.2.3浸提时料液比对多糖提取率的影响浸提时料液比对姬松茸中多糖的提取的影响见图三：Figure3Effectofsolid-liquidrationonextractionyield由图3可见，多糖提取率随料液比的增加而增加，加水量越多，提取的多糖越容易溶解，损失量越少。在料液比达到1：30以后的曲线基本趋于平坦，多糖提取率增幅不明显，但是加水量的增加会增加后续的浓缩时间和负担，并导致更高的能耗,这样的料液比不利于实际生产。所以综合考虑，料液比以1:30为好。3.2.4最佳条件的优化根据以上单因素试验结果,选择浸提温度,浸提时间,料液比为考察因素,以多糖提取率为考察指标,进行正交试验（L933）,确定最佳提取工艺参数。结果见表2。表2正交试验结果Table2Theresultsoforthogonaldesign水平因素浸提温度(℃)浸提时间(h)料液比多糖提取率(%)111118.37212219.62313321.54421218.83522322.11623122.78731320.41832122.72933222.63K159.5357.6163.87K263.7264.4561.08K365.7666.9564.06k119.8419.2021.29k221.2421.4820.36k321.9222.3221.35R2.083.120.99从正交实验的R值可以看出：浸提温度影响较大，其次是料液比，浸提时间选取影响最小。根据极差分析得到的的最佳条件为：A3B3C3。但与实际最佳提取条件不符,需要对其进行验证实验。取100g姬松茸样品按最佳提取条件提取,得到粗多糖提取率为23.01%。经验证得知,A2B3C2为最佳提取条件,即在料液比为1:30,温度为95℃4结论本文确定了姬松茸粗多糖提取的影响因素,得出影响姬松茸提取的主要因素为浸提温度,其次为料液比,再次为浸提时间。用正交试验确定了其优化提取条件为:在料液比为1:30,温度为95℃的条件下浸提3h,姬松茸粗多糖提取率为23.01%参考文献[1]史荣刚．姬松茸研究的现状与展望[J]．江苏食用菌，1995，16(3)：22—23[2]张连富，吉宏武．药食兼用资源与生物活性成分．北京：化学工业出版社．2005．78[3]陈智毅等．巴西蘑菇的食疗价值[J]tp国食用鼠2000，20(4)：47．[4]崔红霞，苏富琴，赵学梅．姬松茸多糖抗肿瘤作用研究．中药药理与临床，2006，22(2)：27[5]王立荣，冯庆荣，徐小元等．姬松茸对慢性肝炎患者肝功影响的临床观察．兰州医学院学报，1994，20(1)：24[6]段县平，马吉飞，郑东虎等．姬松茸多糖对小鼠急性肝损伤的保