实验二十五大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒转化

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附件材实验二十大肠杆菌感受态细胞 及重组质粒的转【目的掌握大肠杆菌感受态细胞 及转化的实验方法和技术熟悉大肠杆菌感受态细胞 及转化的实验原理【原理】大肠杆菌感受态细胞 、转化原细菌的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化， 克隆技术中，转化）特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染（transfection）是指噬菌体、 DNA的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细胞内。本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli.DH-5α细胞,使E.coli.DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来DNA（本实验中的质粒DNA为pUC-18）能力增加，其原理为当细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNAase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并 转化大肠杆菌的筛由于pUC-18（如图）含有Ampr（氨苄青霉素抗性） 便具有在含Amp培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入pUC-18的E.coli.DH-5α细胞，不具有Ampr ，在含Amp的培养基中，生长受到抑 和X-gal的LB平板上，由于pUC-18还带有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶 （lacZ）的启动子及其编码α-片段的DNA序列，此结构成为lacZ＇ ，在lacZ＇ 中的靠近5＇端有一段多克隆位点（MCS），而大肠杆菌含有β-半乳糖苷酶ω片段的编码 活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样lacZ基因在缺少近 区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒图23-1质粒pUC18图23-2质粒pUC18酶切图谱【器材高速温控离心超净工恒温水10ml离心管、1.5m1EP培养皿（φ9cm灯推摇可调微量移液10ml试管、100ml三角瓶恒温培0.45μm、0.22μm滤膜膜【试剂．E.coli.DH-5α．pUC-18质粒（0.5μg/μlLB（Luria-Bertani）液体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g、细菌培养用酵母抽提物（bacto-yeastextract）5g、NaCl10g、加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解。用5mol/LNaOH（约0.2ml）调节pH值至7.4，加去离子水至总体积为1L，以1.034×105Pa高压蒸气灭菌20分钟。．LB固体培上述LB液体培养基中按15g/L加入细菌培养用琼脂（bacto-agar），以1.034×105Pa高压灭菌20分钟。溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液．0.1mol/LCaCl2用蒸馏水溶解11g的CaCl2，定容至1000ml，1.034×105Pa，高压灭菌20分钟，-20℃保存．氨苄青霉素（Amp）溶取未开封氨苄青霉素粉0.5g，加入灭菌蒸馏水5m1，配制成100mg/ml溶液，过滤除菌，-20℃分装保存．IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷取1gIPTG溶于4ml去离子水中，再用水补至5ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1ml分装后，-20℃保存．X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml 液，不需滤过除菌，保存于1.5mlEP管中，用铝箔包于-20℃避光保存．甘油取50ml甘油，121℃,30分钟高温灭菌。【操作．感受态细胞灭菌操作步骤于超净工作台中进行，下同（1）用无菌小枪尖从E.coli.DH-5αLB平板上挑单菌落，将此枪尖放于含5m1LB液体培养基的试管中，37℃，200r/min振荡过夜，第二天将此试管中的5m1LB培养基接种于含100m1LB液体培养基的三角瓶中，37℃，300r/min振荡培养2～4h，到A600一般在0.2~0.4之间（约含5×107个细/ml），为对数生长期或对数生长前（2）将培养物于冰上放置10分钟，然后转移入两个50ml离心管中，4℃，4000r/min离心10分钟，弃去上清，倒置离心管1分钟，流尽剩余液体，加入10m1预冷的CaCl2溶液，轻轻悬浮细菌，置冰浴中10分钟；（3）于4℃，4000rpm离心10分钟回收细胞，轻轻倒去上清，每50ml的原培养物再加入2ml冰冷CaCl2溶液，按200μl一管分装于1.5m1EP管中,若不马上进行转化，该感受态细胞可以加入终浓度为10%的灭菌甘油，置于-70℃冻存。．大肠杆菌质粒转化（热休克法（1）取一支感受态大肠杆菌加入50μl含20ngpUC-18的TE缓冲液，温和混匀，置冰上30分钟，此步骤操作时应设立两个对照组①取50μl含20ngpUC-18的TE缓冲液加入感受态细胞，做阳性对照（A组②不加任何DNA的感受态细胞 对照（B组），仅加入50μlTE缓冲液（2）转移到42℃水浴中放置90秒，迅速放回冰中（3）将细胞冷却1-2分钟后，立即加入0.8m1LB液体培养基，混匀，37℃保温45分钟．转化大肠杆菌的筛（1）Amp然后各取50μlA组、B组中的培养物分别用推子涂布于两块含Amp(100μg/ml)的LB平板中。另作一对照组，另各取50μlA组、B组中的培养物用推子涂布于两块不含Amp的LB平板中。将上述平皿倒置放入37℃恒温培养箱，培养过夜；第二天观察各平皿上细菌生长情况，并作记录。（2）β-半乳糖苷酶系统在预制好的LB琼脂平板（含Amp100μg/ml）上，加上40μl20mg/ml的X-gal和4μl200mg/ml的IPTG溶液；用灭菌推子，将X-gal和IPTG溶液均匀涂布于琼脂凝胶表面，37℃放置3小时，待溶液全部吸入琼脂表面，将取A组50μl细菌涂布于平板中，将平皿倒置放入37℃恒温培养箱，培养过夜,第【注意事项．在实验过程中注意无菌（实验菌除外）操作【思考题 ．药物筛选法和蓝白斑筛选法（α-互补）的原理各是什么．氯化钙法和氯化镁 感受态细胞的优缺点各是什么附：氯化【试剂1×TSS致敏缓冲10%PEG（MW=40005%DMSO（0.45μm过滤50mmol/LMgCl用LB培养 ，调pH值至【操作感受态细胞 及长期冻（一）E.coli.DH-5α菌株于LB培养基中生长至对数前期，然后转移入两个50ml离心管中，4000rpm离心10分钟，弃去上清（二）用5ml的1×TSS致敏缓冲液（冰预冷）悬浮细胞，然后分装成0.1ml一份速置冰上温和混匀， 。使用前，从-70℃取 的感受态细菌