光谱检测技术在生命科学中的应用

第2章光谱检测技术在生命科学中的应用目前一页\总数一百五十一页\编于十九点紫外透照灯1.光谱范围和对应的检测仪器

400nm

650nmUltraVioletVisibleNearInfrared白光透照灯、普通酶标仪、荧光化学发光酶标仪、测序仪、扫描仪显微镜测序仪、扫描仪凝胶图像分析系统、核酸蛋白检测仪、光密度扫描仪、激光扫描仪、荧光显微镜分光光度计、荧光分光光度计、扫描酶标仪目前二页\总数一百五十一页\编于十九点紫外线紫外线是德国物理学家里特在1801年发现的，一切高温物体，如太阳、弧光灯发出的光都含有紫外线。紫外线的作用主要是化学作用。紫外线有很强的荧光效应，能使很多物质发出荧光。目前三页\总数一百五十一页\编于十九点主要部件紫外灯管和滤光片波长254nm、302nm、365nm或2个、3个波长组合一体用于检测凝胶和膜上紫外线激发的荧光染料EB、Sybr-Green等紫外透照仪目前四页\总数一百五十一页\编于十九点可见光

A

可

见

光目前五页\总数一百五十一页\编于十九点主要部件日光灯管和磨砂玻璃波长可见光用于检测凝胶和膜上的染料硝酸银、考马斯亮蓝等及放射自显影胶片白光透照仪目前六页\总数一百五十一页\编于十九点主要部件光学系统（光源、滤光片、光电倍增管）机械运动和定位系统（步进马达）自动控制系统数据处理和传输系统波长：340-700nm用于各种微孔板检测普通酶标仪目前七页\总数一百五十一页\编于十九点Elx-800酶标仪工作原理光电倍增管计算机打印机酶标板滤光片光源目前八页\总数一百五十一页\编于十九点光电效应在光（包括不可见光）的照射下从物体发射出电子的现象叫做光电效应，发射出来的电子叫做光电子。真空光电管：真空的玻璃泡或在内充有少量惰性气体（如氩、氖、氦等）。泡的内半壁涂有碱金属，例如钠、锂、铯，作为阴极K，泡内另有一阳极A。将光电管连在电路里，当光照射到阴极K时，电路里就产生电流，电流的强度取决于照射光的强度。光电管产生的电流很弱，可以用放大器把它放大。目前九页\总数一百五十一页\编于十九点Elx-808酶标仪工作原理滤光片轮卤素灯目前十页\总数一百五十一页\编于十九点组成：CCD摄像头变焦镜、滤光片、近摄镜暗箱紫外透照仪PCI图像捕捉卡图像捕捉及分析软件热敏打印机电脑及显示器（OPTION）功能：图像采集和分析凝胶图像分析系统目前十一页\总数一百五十一页\编于十九点主要部件光学系统（光源、滤光片、光电倍增管）数据处理和传输系统微量比色杯波长：230、260、280、320、562、595nm用于各种生物样品检测核酸蛋白检测仪目前十二页\总数一百五十一页\编于十九点核酸蛋白检测仪滤光片光源比色杯光电倍增管目前十三页\总数一百五十一页\编于十九点主要部件光学系统（光源、单色器、光电倍增管）机械运动和定位系统（步进马达）自动控制系统数据处理和传输系统波长：200-999nm，1nm步进用于各种微孔板检测全波长扫描酶标仪PowerWaveHTSynergy目前十四页\总数一百五十一页\编于十九点全波长扫描酶标仪工作原理目前十五页\总数一百五十一页\编于十九点荧光技术简介目前十六页\总数一百五十一页\编于十九点一、荧光发生过程

荧光产生于某些分子（通常是含多聚芳香烃的碳水化合物或杂环化合物）称为荧光体或荧光染料。荧光探针是一个荧光体设计用于定位生物样品的特异性区域或对特异性刺激因子发生反应。荧光发生是一个3阶段的过程。目前十七页\总数一百五十一页\编于十九点①激发

外源的白炽灯或激光提供的能量（hvEX）的光子被荧光体吸收，产生被激发的电子单峰态（S1’）。这个过程是荧光和化学发光的区别，化学发光的激发态是由化学反应产生的。

目前十八页\总数一百五十一页\编于十九点②激发态的寿命期

激发态存在一个有限的时间（通常是1-10x10-9秒）。在这时间，荧光体经历构象的改变和容易受到分子环境的相互作用的影响。这些过程有两个重要的结果。第一，S1’的能量部分被消耗，形成一个衰减的单峰激发态（S1）即荧光发射的初始。第二，不是最初被激发的所有分子都通过荧光发射回到基态。其他的过程，象振动淬灭，荧光能量传递也在S1’衰减。荧光量子的产生量，取决于激发的荧光光子数量与吸收的光子数量的比率，是衡量荧光效率的参数。

目前十九页\总数一百五十一页\编于十九点③荧光发射

能量（hvEM）光子被激发，荧光体回到基态S0。由于能量在激发态寿命期的部分消耗，这些光子的能量较低，因此比激发光子hvEX有更长的波长。这种由于（hvEM-hvEX）呈现的能量或波长的差异称作Stokes漂移。Stokes漂移奠定了荧光技术灵敏性的基础，因为它可以与激发光子在光谱上分离，而在一个较低的背景下检测发射光子。相比较而言，吸收光分光测定法在透射光检测时相对于较高水平的同一波长的光。

目前二十页\总数一百五十一页\编于十九点EmissionFExcitation荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发光目前二十一页\总数一百五十一页\编于十九点EmissionExcitationF2F1Transfer荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：传递目前二十二页\总数一百五十一页\编于十九点ExcitationBHFTransfer荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发热目前二十三页\总数一百五十一页\编于十九点二、荧光光谱

荧光发生的整个过程是循环的，除非荧光体在激发态不可逆转的破坏（一个重要的现象称作光漂白），同一荧光体可以反复地激发和检测。对于溶液中多原子分子，由hvEX和hvEM呈现的不连续的电子跃迁被一个较宽的能量光谱称作荧光激发光谱和荧光发射光谱取代。在两种或更多的荧光体同时检测时，这些光谱的带宽是非常重要的参数。除了很少的例外，一般在稀释溶液中单种荧光体的荧光激发光谱和它的吸收光谱是相同的。在同样条件下，由于在激发态寿命期激发能量的部分消耗，荧光发射光谱与激发波长是分离的。荧光发射强度是与在激发波长的荧光激发光谱振幅成比例的。目前二十四页\总数一百五十一页\编于十九点荧光光谱目前二十五页\总数一百五十一页\编于十九点三、荧光检测荧光检测仪器

荧光检测系统的4个基本要素是：⑴激发光源，⑵荧光体，⑶将激发光子与发射光子分离的特定波长的滤光片，⑷检测器记录发射光子并输出，通常是电子信号或图像。3种主要的荧光检测仪器提供不同的数据。荧光分光光度计：测定液体样品（uL-mL）荧光显微镜：解析荧光作为二维或三维空间位置定位功能流式细胞仪：测定流体中每个细胞的荧光，在大量样品中进行分选并识别和定量激光扫描仪目前二十六页\总数一百五十一页\编于十九点荧光信号

荧光强度的定量取决于这些参数：吸光度-由Beer-Lambert定律定义为摩尔消光系数的产物，光径和稀释浓度，染料的荧光量子的产量，激发光源强度和仪器荧光采集效率。在稀释溶液或悬液中，荧光强度与这些参数成线性比例关系。当样品吸光度在1cm光径超过0.05时，线性关系被自身吸收和内滤光效应扭曲。通过一个大的荧光Stokes漂移（例如分离为A1和E1）可以容易从Rayleigh散射激发光（EX）分离出荧光发射信号（S1）。标记有荧光探针的生物分子通常都含有超过1个的荧光物，使信号分离更加复杂。另一个光信号（S2）可能是背景荧光或第二个荧光探针。目前二十七页\总数一百五十一页\编于十九点背景荧光

荧光检测的灵敏性会受到背景信号的很大影响，这些背景信号来自样品内在组分（自发荧光）或未结合的和非特异性结合的探针（试剂背景）。检测中可以通过选择滤光片或通过选择更长波长吸收和发射的探针来减小E2自发荧光对E1的影响。尽管将荧光检测带宽变窄增加了E1和E2间的分辨力，但是会影响总的荧光检测强度。对于细胞、组织和生物体液的自发荧光，可以采用激发光＞500nm的探针减小荧光信号失真。但是，较长波长的激发光会受到密度介质如组织的影响而发散减弱，就需要更强穿透力的激发光。目前二十八页\总数一百五十一页\编于十九点荧光的两种检测光路目前二十九页\总数一百五十一页\编于十九点直接标记－将荧光团通过化学反应直接衔接在核酸的双链或单链上间接标记－将带有荧光团标记的NTP或dNTP通过酶反应掺入到新合成的核酸链中荧光对核酸的修饰和标记目前三十页\总数一百五十一页\编于十九点PhysicalDataforIRDye700-CDImax=680nmemission=715nm=190,000LMol-1cm-1PhysicalDataforIRDye800-CDImax=780nmemission=815nm=205,000LMol-1cm-1核酸染料IRDye结构目前三十一页\总数一百五十一页\编于十九点HybridizeLabelDNA5minFastConvenientRobustLowcostIRDyeDNADNALabeling目前三十二页\总数一百五十一页\编于十九点切口平移法随机引物掺入法逆转录合成掺入法AminallyldUTP与荧光团的结合间接荧光标记目前三十三页\总数一百五十一页\编于十九点UniversalLinkageSystem(ULS)platinum-basedchemistry氨基或硫醇基修饰的核酸可直接连接荧光团胞嘧啶的硫化介导的荧光团标记直接荧光标记目前三十四页\总数一百五十一页\编于十九点IRDye800Excitationmax=778nmEmissionmax=806nmE=180,000M-1cm-1Quantumyield=0.34Cy5.5Excitationmax=675nmEmissionmax=694nmE=250,000M-1cm-1Quantumyield=0.28蛋白染料IRDye结构目前三十五页\总数一百五十一页\编于十九点AntigenonMembrane1º1º+2ºOR1º+2º1º+2º+3ºIRDye800andCy5.5SecondaryandTertiaryLabeledAntibodiesLabeledAntibodies目前三十六页\总数一百五十一页\编于十九点主要部件光学系统（光源、滤光片、光电倍增管）机械运动和定位系统（步进马达）自动控制系统数据处理和传输系统波长：激发波长：300-650nm发射波长：350-700nm发光波长：350-700nm用于各种微孔板检测荧光、化学发光酶标仪Flx800Synergy目前三十七页\总数一百五十一页\编于十九点主要部件共聚焦光学系统（激光光源、滤光片、光电倍增管）机械运动和定位系统（步进马达）自动控制系统数据处理和传输系统波长：激发波长：488、514、543、594、633nm发射波长：500-700nm用于玻璃载片的生物芯片检测ScanArray激光共聚焦扫描仪目前三十八页\总数一百五十一页\编于十九点ScanArray激光共聚焦原理目前三十九页\总数一百五十一页\编于十九点ScanArray荧光激发目前四十页\总数一百五十一页\编于十九点显微镜光路图目前四十一页\总数一百五十一页\编于十九点红外线红外线是英国物理学家赫谢尔在1800年发现的。红外线最主要的作用是热作用。红外线的波长较长，因此衍射现象比较显著，穿透力很强。目前四十二页\总数一百五十一页\编于十九点主要部件共聚焦光学系统（激光光源、光电倍增管）机械运动和定位系统（步进马达）自动控制系统数据处理和传输系统波长：激发波长：685、785nm发射波长：715、815nm用于测序红外激光自动测序仪目前四十三页\总数一百五十一页\编于十九点红外激光自动测序仪目前四十四页\总数一百五十一页\编于十九点主要部件共聚焦光学系统（激光光源、光电倍增管）机械运动和定位系统（步进马达）自动控制系统数据处理和传输系统波长：激发波长：685、785nm发射波长：715、815nm用于杂交膜检测红外激光扫描仪目前四十五页\总数一百五十一页\编于十九点红外激光扫描仪原理目前四十六页\总数一百五十一页\编于十九点红外激光扫描仪荧光激发IRD700激发IRD800激发

目前四十七页\总数一百五十一页\编于十九点荧光显微镜光路图目前四十八页\总数一百五十一页\编于十九点滤光片结构图目前四十九页\总数一百五十一页\编于十九点荧光显微镜滤光片光路图目前五十页\总数一百五十一页\编于十九点化学发光技术简介目前五十一页\总数一百五十一页\编于十九点按光谱分类：狭义：可见光（400-700nm）广义：紫外光（10-400nm）可见光（400-700nm）红外光（700-40000nm）光的基本知识目前五十二页\总数一百五十一页\编于十九点炽热光或白炽光(incandescence)-因热而发光气体激发(gasexcitation>-因电子或热的激发而发光摩擦发光(triboluminescence)电激发光(electroluminescence)荧光(fluorescence)-因光激发而发光，但光源切断后即不再发光磷光(phosphorescence)-因光激发而发光，但光源切断后仍会持续发光化学发光(chemiluminescence>-非生物体把多余的化学能转变为光能生物发光(bioluminescence)-生物体利用化学能发光发光物质目前五十三页\总数一百五十一页\编于十九点

某些荧光物质（例如Luminol,C8H7N3O2）可將化学反应中产生的能量，转化成使分子內的电子由基态（groundstate）跃升到激发态（excitedstate），处于激发态的分子并不穩定，將能量以光的形式释放出來；有的光波长为可见光范围，但占多数的是荧光（fluorescence）。化学发光的原理目前五十四页\总数一百五十一页\编于十九点杂交检测中的信号物质（非放射性标记）：核酸杂交（Southern&NorthernBlot）蛋白印迹（WesternBlot）酶联免疫（Elisa）其他：dot/slot杂交、原位杂交、噬菌体文库筛选、菌落文库（质粒文库）筛选…

化学发光在生物学检测中的应用目前五十五页\总数一百五十一页\编于十九点一般需要一定的发光底物及发光增强剂（如CDP-Star，461nm，蓝光）,并配有各自的过氧化物酶系统。经过化学发光及增强作用，将光量放大后，在X片上发光自显影，将特异结合条带显示出来。化学发光检测敏感性高，除借助特殊仪器检测外，需要在暗室进行X光片曝光，曝光时间要掌握适度以便得到最佳信号强度。此外，由于不同发光底物持续发光时间和强度不同，除了摸索曝光时间外还要注意在稳定持续发光时间内可以多次曝光。。

生物学中化学发光检测原理目前五十六页\总数一百五十一页\编于十九点Luminol（～430nm）CSPD发光最强最持久：CDP-Star（～460nm，蓝光）Sapphire-II™发光增强剂Emerald-II™发光增强剂注：一般的试剂盒中已将发光底物与发光增强剂预先混合为发光底物Luminol几种常用的发光底物及增强剂目前五十七页\总数一百五十一页\编于十九点核酸杂交：生物素标探针－酶（AP）标生物素抗体或Strepavidin－CDP-Star底物生物素标探针－酶（AP）标生物素抗体或Strepavidin－CDPD底物生物素标探针－酶（HRP）标生物素抗体或Strepavidin－EnhancedLuminol底物荧光素标探针－酶（AP）标抗荧光素抗体－CDP-Star底物荧光素标探针－酶（HRP）标抗荧光素抗体－EnhancedLuminol底物地高辛标探针－酶（AP）标抗地高辛抗体－CDPD底物酶（专利的耐热AP）标探针－发光底物几种常用的试剂盒检测原理目前五十八页\总数一百五十一页\编于十九点核酸抽提电泳转膜生物素标记探针（随机引物法PCR掺入法）杂交、洗脱酶标生物素抗体或结合物敷育底物敷育化学发光检测：X光片压片－曝光－显影－定影实验流程

举例NEBlotPhototopeKit&Phototope-StarChemiluminescentDetectionKit目前五十九页\总数一百五十一页\编于十九点特点：稳定：32P-标记的探针只能放置几天，而生物素标记的探针可放置较长时间敏感：可检测哺乳动物DNA中的单拷贝基因（<1pg），与同位素相当•

快速：整个检测程序只需40分钟（曝光时间只需1-10分钟，需要优化）•发光可持续几天，可多次曝光，以获取最佳信号强度NEBlotPhototopeKit&Phototope-StarChemiluminescentDetectionKit目前六十页\总数一百五十一页\编于十九点AmbionBioDetectTMNonisotopicDetectionKit举例目前六十一页\总数一百五十一页\编于十九点NEN公司化学荧光素/生物素标发光检测试剂盒晶美公司RNADetector™NorthernBlottingKit

DNADetector™GenomicSouthernBlottingKitTropix（ABI）Southern-Light™ChemiluminescenceNucleicAcidDetectionSystemSouthern-Star™ChemiluminescenceNucleicAcidDetectionSystemAmershamAlkphosLabellingandDetectionSystemRocheDIGLuminescentDetectionKit其他产品目前六十二页\总数一百五十一页\编于十九点酶（AP）标二抗－CDP-Star底物酶（AP）标二抗－CDPD底物生物素标一抗－酶（HRP）标生物素抗体或Strepavidin－ECL试剂ECL:EnhancedChemiluminescence，EnhancedLuminol底物检测限：DAB显色：对HRP敏感，1ngECL化学发光：<pgSuperSignal（PIERCE，ECL）化学发光：10-15fg蛋白杂交目前六十三页\总数一百五十一页\编于十九点CSTPhototope®-HRP化学发光法Western

优点

•

敏感。可检测pg级蛋白质。

•

快速。整个实验过程中不超过2小时。曝光时间从数秒到10分钟。

•

定量。

举例蛋白杂交目前六十四页\总数一百五十一页\编于十九点ECLWesternBlottingDetectionReagentsECLPlusWesternBlottingDetectionReagents（4to20-foldsensitivity）举例AmershamECLProteinBiotinylationModule/System目前六十五页\总数一百五十一页\编于十九点TropixWestern-Light™SystemWestern-Star™System（3-to4-foldsensitivity）酶（AP）标二抗－CDPD/CDP-Star底物举例其他产品目前六十六页\总数一百五十一页\编于十九点酶（AP）标二抗－CDPD/CDP-Star底物酶联免疫目前六十七页\总数一百五十一页\编于十九点四种底物及增强剂搭配方式适用于夹心法，竞争法免疫分析，DNA探针捕获分析配有TR717化学发光酶标仪进行检测举例TropixELISA-LightImmunoassaySystem目前六十八页\总数一百五十一页\编于十九点1.X光片压片（传统方法）但曝光时间需要摸索，压片法有一定不便，定量也不准2.扫描仪一定波长范围扫描3.成像仪CooledCCD4.荧光化学发光酶标仪化学发光检测方法目前六十九页\总数一百五十一页\编于十九点Typhoon™8600

Typhoon™9200

Typhoon™9210

Typhoon™9400

Typhoon™9410

举例AmershamImaging&Analysis扫描仪目前七十页\总数一百五十一页\编于十九点Typhoon9410VariableModeImagerunitesprovenstoragephosphorautoradiographytechnologywithfour-color,non-radioactivefluorescentlabellingtechniques.ForDNA,RNA,andproteinsamples,choosefrom:storagephosphorautoradiographydirectblue-excitedfluorescence(457,488

nm)directgreen-excitedfluorescence(532

nm)directred-excitedfluorescence(633

nm)chemiluminescenceAmershamImaging&Analysis扫描仪目前七十一页\总数一百五十一页\编于十九点WhatImagingSystemdoIneed?OptionalDarkroomforFluorescenceChemiluminescenceonlyGGnSamples>15x12cmCGChemiluminescence&FluorescenceReducedBudgetHigherperformanceCG2XECG2MGUV/whitelightgelsReducedBudgetImagesonlyDGGeneToolsMCSGeneToolsMCSPGeneTools/GeneDirectoryMCSPDGGAddGelAnalysis目前七十二页\总数一百五十一页\编于十九点FromGeniusSeries目前七十三页\总数一百五十一页\编于十九点GeneGnomeFrom目前七十四页\总数一百五十一页\编于十九点BioImagingProductLineDigiDoc-ItSystem DigitalSnapShotBioDoc-ItSystem NoComputer GDS-8000System StandardPC ChemiSystem Expression BioChemiSystem Sensitivity OptiChemiSystem DynamicRange BioMicroSystem RGBColor BioDensitySystem Scanner 举例目前七十五页\总数一百五十一页\编于十九点ChemiSystem

GeneandProteinExpressionPicogramLevelSensitivityDetection2-4TimesLongerThanFilmCooled(-35C)CCDCamera8-BitMaximumSignal-to-NoiseRatioChemiImager4400ChemiDocMultiGenius450,000pixels目前七十六页\总数一百五十一页\编于十九点BioChemiSystemGeneandProteinQuantitationMid-FemtogramLevelSensitivitySameDetectionTimeasFilmCooled(-40C)DigitalCCDCamera12,14and16-BitAcquisitionFluorChem8800VersaDoc3000440CF1.45millionpixels目前七十七页\总数一百五十一页\编于十九点OptiChemiSystemDetailedProteinQuantitationLow-FemtogramLevelSensitivityOneHalftheDetectionTimeasFilmCooled(-85C)DigitalCCDCamera14and16-BitPerformanceFujiLAS-1000VersaDoc5000LumiImager1.40millionpixels目前七十八页\总数一百五十一页\编于十九点FUJIFILMLAS-1000CCDphotoelement举例目前七十九页\总数一百五十一页\编于十九点Tropix公司是化学发光技术专业厂家，专门从事化学发光相关仪器、应用试剂的生产和研发。在化学发光检测技术方面拥有355项专利。TropixTR717化学发光酶标仪（AppliedBiosystems）目前八十页\总数一百五十一页\编于十九点1.灵敏度：数字光子计数器

可检测5×10-21摩尔AP分子，定量线性范围达7个数量级采用光导纤维探头和屏蔽技术，孔间信号相互干扰小于3×10-5，光电倍增管检测器波长范围：380nm～630nm2.灵活性

96孔或384孔微板，可编程读板方式具有两个RS232接口，可兼容目前市售的全自动机械手臂控温范围：室温以上5℃～42℃专利的特氟隆（Teflon）材质进样器，快速均匀混合反应液，保证结果精确性3.应用的广泛性报告基因分析，探针杂交和免疫分析：TropixTR717化学发光酶标仪特性（AppliedBiosystems）目前八十一页\总数一百五十一页\编于十九点紫外与荧光光谱在蛋白质

研究中的应用目前八十二页\总数一百五十一页\编于十九点主要内容UV/vis

基础、实验要点、应用

Fluorescence

基础、实验要点、

常规荧光、淬灭、荧光共振能量传递(FRET)目前八十三页\总数一百五十一页\编于十九点谱学方法目前八十四页\总数一百五十一页\编于十九点10100Kcal/molBondsbreakLightusedforvisionandphotosynthesisElectromagneticspectrumNuclearspinvibrationsElectronictransitionsThelongerthewavelength,thelowertheenergy.目前八十五页\总数一百五十一页\编于十九点基本原理1-LambertLawThefractionoflightabsorbedbyatransparentmediumisindependentoftheincidentintensity,andeachsuccessivelayerofthemediumabsorbsanequalfractionofthelightpassingthroughit.

Log10(I0/I)=kl目前八十六页\总数一百五十一页\编于十九点基本原理2-Beer’sLawTheamountoflightabsorbedisproportionaltothenumberofmoleculesofthechromophorethroughwhichthelightpasses.

k=c目前八十七页\总数一百五十一页\编于十九点DeviationsfromtheBeer-Lambertlaw强吸收

高浓度目前八十八页\总数一百五十一页\编于十九点噪声与误差目前八十九页\总数一百五十一页\编于十九点WavelengthAbsorbanceConcentrationABAB波长选择目前九十页\总数一百五十一页\编于十九点等吸收点(Isosbesticpoint)等吸收点常作为体系中只有两种成分(状态)的指示

可作为参比波长

若有等吸收点,则不需要为为每个谱作基线目前九十一页\总数一百五十一页\编于十九点单光路目前九十二页\总数一百五十一页\编于十九点双光路目前九十三页\总数一百五十一页\编于十九点双波长目前九十四页\总数一百五十一页\编于十九点二极管阵列检测器目前九十五页\总数一百五十一页\编于十九点二极管阵列光谱仪动力学实验目前九十六页\总数一百五十一页\编于十九点常规吸收光谱实验要点样品准备波长选择池子选择扫描速度选择带宽选择石英、玻璃、塑料慢快若样品不稳定若噪声大，分辨率低等窄宽若噪声大合适的浓度，正确的参比目前九十七页\总数一百五十一页\编于十九点紫外/可见光谱在蛋白质研究中的应用浓度测定

构象变化研究

相互作用研究目前九十八页\总数一百五十一页\编于十九点蛋白质主链的紫外吸收肽键在<250nm的远紫外区有较大吸收

目前九十九页\总数一百五十一页\编于十九点蛋白质浓度测定190nm10000l/mol.cm

190nm比280nm大~100倍

但溶剂吸收也较大目前一百页\总数一百五十一页\编于十九点溶剂的吸收目前一百零一页\总数一百五十一页\编于十九点蛋白质中氨基酸的紫外吸收光谱1mM0.1mM0.1mM二硫键在250nm附近有弱吸收目前一百零二页\总数一百五十一页\编于十九点目前一百零三页\总数一百五十一页\编于十九点确定蛋白质的消光系数可以根据蛋白质序列预测蛋白质的消光系数

ProtParam:/tools/protparam.html目前一百零四页\总数一百五十一页\编于十九点Tyr的吸收谱与pH有关pHtitrationcanbeusedtodetermine

-

whetherTyrisinternalorexternal

-polarityofenvironmentmaxatpH6:274nmmaxatpH13:295nm目前一百零五页\总数一百五十一页\编于十九点环境极性的影响BlueshiftofspectrainpolarsolventWeakerabsorptionofTyrinpolarsolvent目前一百零六页\总数一百五十一页\编于十九点蛋白质构象变化研究AbsorptionspectraofPoly-L-LysHCl:randomcoilatpH6.0,25ºC(bold);-HelixatpH10.8,25ºC(dotted);-strandatpH10.8,52ºC(dashed).目前一百零七页\总数一百五十一页\编于十九点蛋白质折叠/变性研究目前一百零八页\总数一百五十一页\编于十九点荧光光谱目前一百零九页\总数一百五十一页\编于十九点0330TheFranck-Condonprinciple:transitionsareverticalinbothabsorptionandemissionTheFranck-Condonfactoristhesameforabsorptionandfluorescence00011003063060Exceptions:-verylonglivedS1state:emissionoccursfromadifferentgeometry.-Reactionsfromtheexcitedstate.目前一百一十页\总数一百五十一页\编于十九点量子产率F=发射的光子数/吸收的光子数

目前一百一十一页\总数一百五十一页\编于十九点荧光强度IF=I0(1-10-cl)F

若cl很小，则近似：IF=I0(cl)FInnerfiltereffect

目前一百一十二页\总数一百五十一页\编于十九点Innerfiltereffect所以，实验中，A,EX<0.1目前一百一十三页\总数一百五十一页\编于十九点RamanandRayleighScatteringTwopotentialsourcesofbackgroundradiationareRamanandRayleighscattering.Bothofthesephenomenaariseduetovibrationalchangesinducedinmoleculesbyincidentradiation.Bothcanalsobedescribedasscatteredlight.TheRamanlinesareofdifferentfrequencyfromtheincidentlightandusuallyoflongerwavelength.Rayleighradiationisscatteredlightofthesamefrequencyastheincidentlight.目前一百一十四页\总数一百五十一页\编于十九点RayleighScattering强度与r6/4成正比不能通过减空白来消除

选择合适的激发波长从比激发波长大(10nm)处开始收谱减少带宽目前一百一十五页\总数一百五十一页\编于十九点Ramanscattering因水中O-H收缩(3300cm-1):

1/

RA=1/EX–0.00033目前一百一十六页\总数一百五十一页\编于十九点EnvironmentalSensitivityFluorophorescanbeaffectedbyalargenumberofenvironmentalfactorsincludingsuchparametersaspH,ionicstrength,non-covalentinteractions,lightintensity,temperatureandsoon.

Boththeexcitationandemissionwavelengthsandthequantumyieldcanallbechangedbyenvironmentalfactors.目前一百一十七页\总数一百五十一页\编于十九点温度荧光一般随温度上升而减弱荧光实验需要恒温目前一百一十八页\总数一百五十一页\编于十九点2waysofmeasuringfluorescenceEmissionspectrum-excitationλconstant,measurefluorescenceintensityofemissionagainstλ,I.e.spectrumofemittedlight.Excitationspectrum–measurefluorescenceintensityatdifferentexcitationλ,similartoabsorptionspectra.目前一百一十九页\总数一百五十一页\编于十九点ExcitationspectrumExcitationspectrumshouldcorrespondcolselywiththeabsorptionspectrumofthemoleculethatisresponsibleforthefluorescence.Excitationspectrumrevealswhetherthesampleishomogeneous,andwhetherallfluorescencefeaturesresultfromasinglemolecule.目前一百二十页\总数一百五十一页\编于十九点ExperimentsSpectralshifts:Intrinsic,

Extrinsic

FluorescenceFluorescencequenching:Internal,ExternalFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)Rotationofmolecules:fluorescenceanisotropyFluorescencelifetime…..目前一百二十一页\总数一百五十一页\编于十九点ProteinintrinsicfluorescenceTrpfluorescencecanbeselectivelyexcitedat295-305nm.(toavoidexcitationofTyr)目前一百二十二页\总数一百五十一页\编于十九点Trpisthedominantintrinsicfluorophoreinproteins目前一百二十三页\总数一百五十一页\编于十九点Trpfluorescence

isverysensitivetoitslocalenvironmentItispossibletoseechangesinemissionspectrainresponsetoconformationalchanges,subunitassociation,substratebinding,denaturation,andanythingthataffectsthelocalenvironmentsurrondingtheindolering.Also,Trpappearstobeuniquelysensitivetocollisionalquenching,eitherbyexternallyaddedquenchers,orbynearbygroupsintheprotein.目前一百二十四页\总数一百五十一页\编于十九点LocalelectricfieldscausespectralshiftsGasphasemm*solventSolventcanaffectthegroundstateandexcitedstatemoleculescausingspectralshiftExample:Hbondingtotryptophan.Changesitsabsorptionbyabout10nm目前一百二十五页\总数一百五十一页\编于十九点FluorescenceoftryptophandependsuponthedipolarnatureofthesolventCa-parvalbumin:tryptophanisburied,305nmCa-freeparvalbumin:tryptophanisexposedtosolventTryptophaninvarioussolvents:hexane,trehaloseglass,glycerol,waterFluorescencespectralshiftscanbeverylarge目前一百二十六页\总数一百五十一页\编于十九点Tyrfluorescence若蛋白质只含TYR,不含TRP：

蛋白质变性后，荧光强度明显增强。目前一百二十七页\总数一百五十一页\编于十九点GFPisisolatedfromthePacificjellyfishAequoreavictoriaandnowplayscentralrolesinbiochemistryandcellbiologyduetoitswidespreaduseasaninvivoreporterofgeneexpression,celllineage,protein­proteininteractionsandproteintrafficking

GFPcanbefusedtoanotherproteineitherN-orC-terminally.ThisisduetothefactthatbothterminiofGFPappearratherflexibleonthesurfaceofthebeta-can,sothatGFP'sstructureisnotsignificantlydistortedordestroyedbythefusedprotein.RibbondiagramoftheGreenFluorescentProtein(GFP)drawnfromthewild-typecrystalstructure.Theburiedchromophore,whichisresponsibleforGFP'sluminescence,isshowninfullatomicdetail.GreenFluorescentProtein(GFP)目前一百二十八页\总数一百五十一页\编于十九点Differentcolourformsof

GFPAdditionallyseveraldifferentcolourformsof

GFP

havebeenproduced.

blue,

cyan,

green,and

yellow

FPorBFP,CFP,GFPandYFP.目前一百二十九页\总数一百五十一页\编于十九点目前一百三十页\总数一百五十一页\编于十九点Fluorescenceemissionspectraofequalconcentrationsof1,8-ANSinethanol:watermixtures.Thelabelsadjacenttoeachcurveindicatethepercentageofethanolinthesolventmixture.ProteinExtrinsicfluorescenceANS(1-anilinonaphthalene-8-sulfonicacid)1-苯胺基萘-8-磺酸strongfluorescenceenhancementwhenitsexposuretowaterislowered目前一百三十一页\总数一百五十一页\编于十九点Fluorescenceenhancementof1,8-ANS,uponbindingtoprotein.Theimageshowsaqueoussolutionsof1,8-ANSexcitedbyultravioletlight.Additionofprotein(bovineserumalbumin)tothesolutioninthecuvetteontheleftresultsinintensebluefluorescence.Thefluorescenceofuncomplexedfreedyeinthecuvetteontherightisnegligibleincomparison.1,8-ANSisasensitiveprobeforpartiallyfoldedintermediatesinprotein-foldingpathways.MoltenglobuleintermediatesarecharacterizedbyparticularlyhighANSfluorescenceintensitiesduetotheexposureofhydrophobiccoreregionsthatareinaccessibletothedyeinthenativestructure.目前一百三十二页\总数一百五十一页\编于十九点ANSbindingofsHSP16.5inGdnHCl

目前一百三十三页\总数一百五十一页\编于十九点TitrationofANSfluorescenceat475nm

目前一百三十四页\总数一百五十一页\编于十九点Haemoglobinisacomplexofasmallprostheticgroupwiththeproteinapohaemoglobin.TheextrinsicfluorANSfluoresceswhenaddedtosolutionsofapohaemoglobinbutnotwithhaemoglobin.Theadditionofhaemtotheapohaemoglobin-ANScomplexeliminatesthefluorescencebydisplacingANS.ThistellsusthatANSandthehaemgroupbindtothesamesite.SinceANSisonlyfluorescentinhighlynon-polarenvironments,thehaemmustbindtoahighlynon-polarsite.ThiswouldgivevaluablecluesintheinterpretationofX-raydiffractionpatterns.E.g.youwouldknowthatacertainconfigurationofaminoacidscouldbethepointofinteractionbetweenhaemandproteinwhenbuildingthestructure.Extrinsicfluorescenceexamples目前一百三十五页\总数一百五十一页\编于十九点FluorescenceQuenchingInternalquenchingduetointrinsicstructuralfeaturee.g.structuralrearrangement.Externalquenchinginteractionoftheexcitedmoleculewithanothermoleculeinthesampleorabsorptionofexcitingoremittedlightbyanotherchromophoreinsample.目前一百三十六页\总数一百五十一页\编于十九点IntramolecularquenchingTyroftenisquenchedbynearbytryptophanesTrpfluorescencecanbequenchedbyneighbouringprotonatedacidgroups.IfthepKmeasuredbymonitoringtrpfluorescenceisthesameasthepKforaknownionisablegroup(e.g.acarboxyl)thenthegroupmustbenearthetrp.目前一百三十七页\总数一百五十一页\编于十九点ExternalquenchingAcrylamide,I-,Cs+目前一百三十八页\总数一百五十一页\编于十九点Stern-VolmerequationFluorescencequenchingisafunctionof:TheexcitedstatelifetimeThediffusion-limitedquenchingconstantTheconcentrationofthequencherTheSternVolmerslope:

KSV=skQF0/F

=1+tskQ[Q]Stern-VolmerequationAsafirstproximationthevalueofKSVrevealsthedegreeOfexposuretothesolventofaTrpresidue.目前一百三十九页\总数一百五十一页\编于十九点,0M,1M,2M,3M,4M,5M,6MStern-VolmerplotatvariousGdnHClconcentrationsAcrylamidequenchingofTrpfluorescence

目前一百四十页\总数一百五十一页\编于十九点Stern-Volmerconstants

目前一百四十一页\总数一百五十一页\编于十九点FluorescenceResonanceEnergyTransferKnownasfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)orFörsterenergytransfer.Itistheradiationlesstransferofexcitationenergyfromadonortoanacceptor.Animportantconsequenceofthistransferisthatthereisnoemissionoflightbythedonor.Theacceptormayormaynotbefluorescent.FRETisadistance-dependentinteractionwheretheenergytransferoccurstypicallyoveradistanceof1-10nm.ThedistancedependentnatureofFRETishighlightedbythefactthatitisproportionaltotheinversesixthpoweroftheintermolecularseparation.

目前一百四十二页\总数一百五十一页\编于十九点Ifthefluorophores(extrinsicorintrinsic)haveuniquelocationswithintheproteinorcomplex,itispossibleforemissionlightenergyfromAtobeabsorbedbyBandtobeemittedaspartofB’semissionspectrumA/QFluorAλ2λ1AbsorbanceemissionA/Qλ(nm)FluorBλ2λ3AbsorbanceemissionFluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)目前一百四十三页\总数一百五十一页\编于十九点FRETisdependentonthedistance,R,betweenthetwofluors.Usedtomeasuredistancesinproteins,membranes,¯omolecularassemblies10to80Åapart.Efficiencyoftheenergytransfer(E)fromdonortoacceptor(AtoB)definedbyE=R06

R06+R6

R=distancebetweenA&B,R0isaconstantcalculatedfromabsorptionandemissionspectra.Ecanbecalculatedfromfluorescenceintensity(F)

E=Fda/FdFda=Finthepresenceofacceptor,Fd=Fintheabsenceofacceptor.OnceEisknown,Rcanbecalculatedfromthefirstequation

ifR0isknown.FRETisusedasa‘spectroscopicruler’目前一百四十四页\总数一百五十一页\编于十九点theC-terminalsubdomainofthemoleculeformsanensembleofcompactlooselyfoldedconformationswithnative-likefeatures.FRET应用实例目前一百四十五页\总数一百五十一页\编于十九点IntramolecularandintermolecularFRET.(a)IntramolecularFRETcanoccurwhenboththedonorandacceptorchromophoresareonthesamehostmolecule,whichundergoesatransition,forexample,between‘open’and‘closed’conformations.IneachsquareboxcorrespondingtoCFPorYFP(shownincyanoryellow,respectively),adiagonallinerepresentsthechromophore.TheamountofFRETtransferredstronglydependsontherelativeorientationanddistancebetweenthedonorandacceptorchromophores:theparallelorientationandtheshorterdistance(<100Å)generallyyieldlargerFRET.(b)IntermolecularFRETcanoccurbetweenonemolecule(proteinA)fusedtothedonor(CFP)andanothermolecule(proteinB)fusedtotheacceptor(YFP).Whenthetwoproteinsbindtoeac