PCR测定中常见问题分析

核酸检测过程分析后采集容器采集方式保存运输不合格样本：脂血、溶血、样本量不足样本分析中分析前设备状态仪器：日维护开机自检准备试剂配制核酸扩增结果分析结果记录核酸纯化检测系统试剂设备质控品人员操作核酸检测1目前一页\总数二十六页\编于十五点结果不准确

问题出在哪？试剂耗材的质检标本的采集与储存仪器设备清洁维护（仪器设备状态）人员操作--试剂准备人员操作--样本的制备--核酸纯化人员操作--加样设备状态--扩增、检测结果分析报告解释污染控制目前二页\总数二十六页\编于十五点标本的采集与储存1.采集的容器例如：血液样本，采血管规格，抗凝剂种类？容器到达实验室时应处于未曾开启状态2．样本的保存检测前、检测后保存容器？纯化后DNA的保存避免反复冻融

目前三页\总数二十六页\编于十五点仪器设备状态1.仪器设备校准加样器方式：计量部门、厂家、自校准扩增仪方式：厂家温浴设备、温湿度计2.设备状态清洁维护

目前四页\总数二十六页\编于十五点试剂的配制保证反应的均一性，每次试验的扩增反应混和液应一次配出，并至少多配1人份。配制时注意：试剂充分复融、混匀，开盖前瞬时离心；配制后充分混匀，但不可剧烈震荡，分装前瞬时离心。

配制后不宜放置过久，因为PCR/RT-PCR反应液中的酶、引物、底物在低温与室温下均可按较低的效率起反应而消耗部分原料产生非特异的引物二聚体等，造成扩增效率降低，一般的建议是配制完PCR反应液后的0.5—3小时内应及时上机扩增，加模板后应尽快上机目前五页\总数二十六页\编于十五点试剂准备、加样试剂配制的均一性、分装的均一性常用试剂的分装、储存及使用容器加样准确性和重复性

加样量目前六页\总数二十六页\编于十五点样本的制备----核酸纯化核酸提取方法人员操作仪器设备状态样本量

目前七页\总数二十六页\编于十五点样本的制备----核酸纯化一般原理：均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。一般步骤：去垢剂裂解--蛋白酶处理--有机溶剂提取--乙醇沉淀等步骤。纯化目的：核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。

1.核酸提取方法目前八页\总数二十六页\编于十五点样本的制备----核酸纯化纯化质量评价：抑制物的去除来自样本--血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。

来自提取过程--乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。保证措施：对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施；核酸提取及扩增有效性的质控目前九页\总数二十六页\编于十五点样本的制备----核酸纯化2.人员操作

加样的准确避免交叉污染振荡的幅度、时间温育的温度、时间

……目前十页\总数二十六页\编于十五点样本的制备----核酸纯化3.仪器设备状态离心机金属浴/水浴加样器全自动样本处理系统目前十一页\总数二十六页\编于十五点样本的制备----核酸纯化1．纯化的原则

防止和抑制DNase对DNA的降解；

尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；

将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。2．可能出现的问题模板中含有杂蛋白质，特别是染色体中的组蛋白模板中含有Taq酶抑制剂；在提取制备模板时丢失过多，提取效率低提出过程中引入的有机溶剂未去除。?目前十二页\总数二十六页\编于十五点样本的制备----核酸纯化4.样本量50l样本灵敏度500IU/ml200l样本灵敏度50IU/ml?目前十三页\总数二十六页\编于十五点扩增、检测1．加模板（上样）加入提取好的核酸模板时需格外小心，往往PCR扩增所需加入的模板量只有2μl，加样器的使用显得尤其重要，须控制加样精密度于准确的。

扩增管盖子要盖紧，管盖没有盖好造成PCR反应液热蒸发，影响反应温度的准确控制及反应也各成份的浓度，同时也成为一个污染源。（压盖时由于粗心或者用力不均致使部分盖子变形，也是实验室常见的问题）目前十四页\总数二十六页\编于十五点扩增、检测熟悉仪器设备的特点，标本的放置，参数设置……扩增、检测

影响因素：引物、探针、仪器设备状态扩增效率：目前十五页\总数二十六页\编于十五点关于污染1．样本的污染

微生物、操作人员、标本之间的交叉污染2．扩增产物或模板的污染

试剂、加样器、操作台面…

PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)

，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。

气溶胶：空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染，据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝。目前十六页\总数二十六页\编于十五点关于污染1．样本的污染

微生物、操作人员、标本之间的交叉污染2．扩增产物或模板的污染

试剂、加样器、操作台面…

PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)

，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。

气溶胶：空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染，据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝。目前十七页\总数二十六页\编于十五点关于污染3.污染的监测--阴性对照

每次PCR实验务必做阴性对照，它包括：

阴性标本对照

空白试剂对照目前十八页\总数二十六页\编于十五点关于污染4．防止污染的方法实验室合理分区制定工作流程并严格执行实验室的清洁使用哪种消毒（去污染）剂？设备、加样器、工作台面….选择盐酸还是次氯酸？

去污染效果取决于有效氯的浓度：0.05–0.5%目前十九页\总数二十六页\编于十五点关于污染5．何时、怎样去污染？

喷洒10%bleach15-30min清水擦

每次PCR后和泄漏时进行目前二十页\总数二十六页\编于十五点目前二十一页\总数二十六页\编于十五点目前二十二页\总数二十六页\编于十五点关于污染

含氯消毒液的稀释和贮存：用洁净的水稀释消毒液，自来水虽然方便，但是次氯酸不稳定，尤其是在水质较硬的情况下；尽量新鲜配置，1：10稀释的消毒液，1-2周稳定；稀释的含氯消毒液放在室温不透明的容器里；将稀释的次氯酸消毒液放在常规使用的喷雾瓶中，放在水槽下。温度、光照和氧化作用都可以使之分解变质。目前二十三页\总数二十六页\编于十五点关于污染紫外灯的使用

紫外波长（nm）一般选择254/300nm

照射30min即可

有效距离：60-90cm需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。目前二十四页\总数二十六页\编于十五点其他细节问题加样器

吸样器污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而