NO参与烟草细胞渗透调节和机械刺激及光质对烟叶的效应(柯学博士论文答辩)

NO参与烟草细胞渗透调节和机械刺激及光质对烟叶的效应研究生：柯学导师：龚明教授

专业：农业生物环境与能源工程

研究方向：农业生物环境工程

博士学位论文答辩目前一页\总数四十七页\编于十五点研究目的与意义研究现状研究内容结果结论博士学位论文答辩目前二页\总数四十七页\编于十五点研究目的与意义多种环境因子影响农作物的生长和产量逆境胁迫伤害植物对逆境胁迫的响应与适应为农作物种植、遗传育种及基因工程改良提供理论指导本文以烟草悬浮细胞和植株为材料，研究了一氧化氮(nitricoxide,NO)在烟草细胞对渗透胁迫及机械刺激响应与适应中的作用及光质对烟草叶片生长发育的调控博士学位论文答辩目前三页\总数四十七页\编于十五点研究现状NO作为信号分子广泛参与植物生长发育、逆境胁迫响应过程NO与其它信号分子(Ca2＋，ROS，ABA)的相互作用NO与植物抗渗透胁迫NO与机械刺激光质对光合作用及植物生长发育的影响博士学位论文答辩目前四页\总数四十七页\编于十五点研究内容NO在烟草悬浮细胞对渗透胁迫响应与适应中的作用NO的产生细胞活力、死亡率和再生能力细胞水势、渗透势和压力势脯氨酸代谢相关酶活性及基因表达机械刺激诱导的烟草悬浮细胞NO产生途径及其与Ca2+和钙调素的关系NO的产生及途径Ca2+/CaM对NO产生的调控作用不同光质对烟草叶片生长发育及光合作用特性的影响生长发育相关指标叶片的组织结构类半胱氨酸蛋白酶活性及基因表达光合作用参数和叶绿素荧光参数Rubisco酶活性及rbc、rca基因表达博士学位论文答辩目前五页\总数四十七页\编于十五点结果第一部分：NO在烟草悬浮细胞对渗透胁迫响应与适应中的作用渗透胁迫诱导胞内NO产生的模式NO供体SNP对烟草细胞抗渗透胁迫能力的影响SNP对渗透胁迫下细胞渗透调节能力的影响SNP对渗透胁迫下烟草细胞脯氨酸积累的影响SNP对渗透胁迫下烟草细胞脯氨酸代谢相关酶活性及基因表达的影响博士学位论文答辩目前六页\总数四十七页\编于十五点PEG6000和NaCl处理下烟草悬浮细胞内NO的动态变化荧光法Griess法渗透胁迫处理能诱导烟草细胞产生NO目前七页\总数四十七页\编于十五点不同浓度PEG6000和NaCl处理对烟草悬浮细胞的细胞活力、细胞死亡率和细胞再生能力的影响PEG6000NaCl渗透胁迫强度：8.5%PEG6000100mmol·L-1NaCl目前八页\总数四十七页\编于十五点不同浓度SNP预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞活力的影响PEG6000NaClSNP预处理浓度：100mmol·L-1(PEG6000)150mmol·L-1(NaCl)目前九页\总数四十七页\编于十五点PEG6000NaCl不同浓度cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下SNP提高烟草悬浮细胞活力的逆转效应

cPTIO预处理浓度：40mmol·L-1(PEG6000)80mmol·L-1(NaCl)目前十页\总数四十七页\编于十五点PEG6000NaClSNP及cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞的细胞活力、细胞死亡率及细胞再生能力的影响外源NO供体SNP提高了PEG6000和NaCl胁迫下细胞活力、细胞再生能力，降低细胞死亡率，而NO清除剂cPTIO能逆转SNP的效应。这表明NO能增强烟草细胞的抗渗透胁迫能力目前十一页\总数四十七页\编于十五点

SNP处理对正常培养烟草悬浮细胞的水势(yw)、渗透势(ys)和压力势(yp)的影响外源NO供体SNP处理促使烟草细胞发生渗透调节水势渗透势压力势目前十二页\总数四十七页\编于十五点

SNP和cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞的水势(yw)、渗透势(ys)和压力势(yp)的影响PEG6000NaCl外源NO供体SNP提高了渗透胁迫下烟草细胞的渗透调节能力，SNP预处理能通过降低细胞的渗透势，减缓水势的降低，进而维持细胞的压力势，而NO清除剂cPTIO能消除SNP的作用

目前十三页\总数四十七页\编于十五点不同浓度SNP处理对正常培养的烟草悬浮细胞脯氨酸积累的影响

外源NO供体SNP能诱导正常培养条件下烟草细胞脯氨酸的积累目前十四页\总数四十七页\编于十五点外源NO供体SNP能诱导烟草细胞脯氨酸的积累，并且在渗透胁迫下，SNP能更大幅度增加脯氨酸的积累量SNP和cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞脯氨酸积累的影响PEG6000NaCl目前十五页\总数四十七页\编于十五点SNP和cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞GDH活性的影响

PEG6000NaCl外源NO供体SNP能提高渗透胁迫下烟草细胞的GDH活性目前十六页\总数四十七页\编于十五点SNP和cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞P5CS活性的影响

PEG6000NaCl外源NO供体SNP对烟草细胞P5CS活性无显著影响目前十七页\总数四十七页\编于十五点SNP和cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞精氨酸酶活性的影响

PEG6000NaCl外源NO供体SNP能提高渗透胁迫下烟草细胞精氨酸酶活性目前十八页\总数四十七页\编于十五点SNP和cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞OAT活性的影响

外源NO供体SNP能提高渗透胁迫下烟草细胞OAT活性PEG6000NaCl目前十九页\总数四十七页\编于十五点SNP和cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞PDH活性的影响

PEG6000NaCl外源NO供体SNP能降低渗透胁迫下烟草细胞PDH活性目前二十页\总数四十七页\编于十五点渗透胁迫下，外源NO供体SNP能增强GDH和OAT的表达，减弱PDH的表达SNP和cPTIO预处理对PEG6000和NaCl胁迫下烟草悬浮细胞GDH、OAT和PDH基因表达的影响

PEG6000NaCl目前二十一页\总数四十七页\编于十五点第一部分结果小结：渗透胁迫诱导了烟草细胞NO的快速产生，外源NO提高了细胞的渗透调节能力。NO参与的渗透调节可能主要通过调控脯氨酸代谢关键酶进而增加细胞的脯氨酸积累量来实现。实验从细胞水平上证明了NO对脯氨酸代谢的调控是烟草细胞抗渗透胁迫能力形成的重要机制博士学位论文答辩目前二十二页\总数四十七页\编于十五点结果第二部分：机械刺激诱导的烟草悬浮细胞NO产生途径及其与Ca2+和钙调素的关系机械刺激可诱导烟草悬浮细胞迅速产生NONOS在机械刺激诱导NO产生中的作用Ca2+/CaM对机械刺激诱导烟草细胞NO产生的影响博士学位论文答辩目前二十三页\总数四十七页\编于十五点不同强度机械刺激处理30min对烟草悬浮细胞NO积累的影响

150r·min-1机械刺激下烟草悬浮细胞NO含量动态变化及其cPTIO的效应机械刺激能诱导烟草悬浮细胞快速产生NO,这种NO的产生被NO的清除剂cPTIO显著抑制目前二十四页\总数四十七页\编于十五点150r·min-1机械刺激下烟草悬浮细胞NOS活性动态变化L-NMMA(500µmol·L-1)和NaN3(100µmol·L-1)预处理对机械刺激(MS,150r·min-1，30min;Non-MS为对照)诱导的烟草悬浮细胞NO产生的影响机械刺激诱导烟草悬浮细胞产生NO的主要途径是(类)NOS催化的精氨酸依赖途径目前二十五页\总数四十七页\编于十五点外源EGTA(A)和Ca2+(B)处理对机械刺激(150r·min-1，30min)诱导的烟草细胞NO产生的效应EGTACa2+减少胞内Ca2+含量对机械刺激诱导的烟草悬浮细胞NO的产生有显著影响目前二十六页\总数四十七页\编于十五点TFP和CPZ处理对机械刺激(150r·min-1，30min)诱导的烟草细胞NO产生的效应La3+和RR处理对机械刺激(150r·min-1，30min)诱导的烟草细胞NO产生的效应

机械刺激诱导烟草悬浮细胞NO的产生受胞内Ca2+通道抑制剂抑制和钙调素抑制剂抑制目前二十七页\总数四十七页\编于十五点150r·min-1机械刺激下烟草悬浮细胞CaM活性动态变化机械刺激处理能够引起烟草细胞内CaM活性变化目前二十八页\总数四十七页\编于十五点第二部分结果小结：(类)NOS催化的精氨酸依赖途径可能是机械刺激诱发烟草细胞NO产生的主要途径，Ca2+/CaM可能通过调节(类)NOS活性来调控NO的产生博士学位论文答辩目前二十九页\总数四十七页\编于十五点结果第三部分：不同光质对烟草叶片生长发育及光合作用特性的影响各种滤膜下的光谱参数不同光质处理下烟草叶片的生长状况不同光质处理下烟草叶片的组织解剖结构不同光质处理对烟草叶片类半胱氨酸蛋白酶活性及VPEs基因表达的影响不同光质对烟草叶片光合色素含量的影响不同光质对烟草叶片光合作用参数的影响不同光质对烟草叶片Rubisco羧化酶活性及rbc和rca基因表达的影响不同光质对烟草叶片叶绿素荧光参数的影响博士学位论文答辩目前三十页\总数四十七页\编于十五点光质处理：滤膜(聚乙烯树脂，厚度0.08mm)滤膜颜色Colourofthefilms滤过波长Wavelength(nm)波峰Wavepeak(nm)透光率Lighttransmission(%)白（W）--69*红（R）600-72067070黄（Y）540-63059073蓝（B）450-50047068*紫（P）400-47045072各滤膜下的光谱组成(参数)目前三十一页\总数四十七页\编于十五点不同光质处理对烟叶长(A)、宽(B)及长宽比(C)的影响

叶长/宽比不同光质处理对叶面积有一定影响，但蓝膜下的叶长、叶宽较小，黄膜下的叶长/宽比较大叶宽叶长目前三十二页\总数四十七页\编于十五点红、蓝膜下的叶片更厚，有较小的比叶面积，黄膜处理下的则相反不同光质处理对烟叶比叶面积的影响

不同光质处理对烟叶厚度的影响

目前三十三页\总数四十七页\编于十五点不同光质对烟叶组织结构的影响70mmW-7dTW-42dEH石蜡切片图(400×，番红-固绿染色)。W-7d,表示白膜下叶龄7d时的切片。T，腺毛（trichome）；EH，表皮毛(epidemichair)；UE，上表皮（upperepidemic）；LE，下表皮(lowerepidemic)；S，气孔(stoma)；SC，孔下室(stomacavity)，PT，栅栏组织(palisadeparenchyma)，ST，海绵组织(spongyparenchyma)，TI，组织空隙(tissueinterspace)目前三十四页\总数四十七页\编于十五点不同光质对烟叶组织结构的影响在叶龄7~70d内，不同光质处理叶片各测量指标的变化趋势基本一致42d叶龄时，叶厚、栅栏组织厚、栅栏细胞密度，红、蓝膜处理的较大；叶厚、海绵组织厚，黄膜的较小；组织比，黄、蓝、紫膜的较大；组织空隙率，黄膜的较大切片拍照：Zeiss数码显微镜（AxioImagerA2m）数据处理：ImageTool3.0图像分析软件目前三十五页\总数四十七页\编于十五点不同光质处理下烟叶类半胱氨酸蛋白酶-1相对活性的变化

不同光质处理下烟叶液泡加工酶(VPEs)基因表达的变化

红膜红膜

黄膜蓝膜紫膜

7~70d的生长期内，各处理烟叶的类半胱氨酸蛋白酶-1活性变化趋势基本一致，总体上，红、黄膜处理叶片的酶活性较高，蓝、紫膜处理的酶活性较低类半胱氨酸蛋白酶中的液泡加工酶VPEs基因表达,总体上，表达量在叶片生长后期明显上调，蓝膜和紫膜处理的表达量较低，红膜和黄膜处理的表达量较高结果表明类半胱氨酸蛋白酶参与调控烟草叶片的生长发育进程目前三十六页\总数四十七页\编于十五点不同光质处理对烟叶光合色素含量的影响蓝膜下叶片的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素均最低，而红、蓝膜下的叶绿素a/b比值却较高

叶绿素a叶绿素b总叶绿素类胡萝卜素叶绿素a/b比目前三十七页\总数四十七页\编于十五点不同光质处理对烟叶光合作用的影响A：净光合速率B：气孔导度C：胞间CO2浓度D：蒸腾速率

红、蓝、紫膜下叶片有较高的净光合速率，与之相似的是，红、蓝、紫膜下叶片的气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率均较高，而黄膜下的较低目前三十八页\总数四十七页\编于十五点红、蓝、紫膜下叶片的Fv/Fm、fPSII和qP均较高，黄膜下的fPSII和qP较低，紫膜下的NPQ较高不同光质处理对烟叶叶绿素荧光参数的影响A，初始荧光强度(F0)B，最大荧光强度(Fm)C，PSII最大光化学量子效率(Fv/Fm)D，PSII实际光化学量子效率(ФPSII)E，光化学猝灭系数(qp)F，非光化学猝灭系数(NPQ)目前三十九页\总数四十七页\编于十五点CO2响应曲线相关参数光响应曲线最大光合速率（Pnmax）(µmolCO2.m-2s-1)羧化速率（CE）光呼吸（Rp）(µmolCO2.m-2s-1)拟合曲线R2CO2补偿点(Cic)(µmol.mol-1)CO2饱和点(Cisat)(µmol.mol-1)白膜（W）31.20.05224.08540.998578.31297.5红膜（R）26.10.04103.40550.994683.11218.3黄膜（Y）20.40.03803.48660.997691.81174.9蓝膜（B）33.40.06286.22860.996899.21334.6紫膜（P）23.70.03873.04150.993678.61265.7

不同光质处理下烟叶的光响应曲线

A~E:实测及拟合曲线Mv，实验中的实际测定值Pv，根据拟合曲线得出的预测值Lc，光补偿点Lsat，光饱和点Pmax，最大净光合速率Ф，表观量子效率Rd，暗呼吸速率R2，拟合曲线决定系数F:PAR≤200µmol·m-2·s-1时实际测定值的Pn-PAR直线回归不同光质处理下烟叶的CO2响应拟合曲线相关参数各处理叶片的光补偿点和CO2补偿点相差不大，但红、蓝、紫膜下叶片的光饱和点和CO2饱和点较高由拟合曲线估计的最大光合速率和表观量子效率，红、蓝、紫膜下的较高，而黄膜下的较低目前四十页\总数四十七页\编于十五点不同光质处理下烟叶Rubisco羧化酶活性(A)及净光合速率(B)的变化

不同光质处理对烟叶rbc和rca基因表达的影响

红、蓝、紫膜处理提高了叶片Rubisco羧化酶的活性，而黄膜处理下的活性较低

在烟叶生长发育过程中，rbc和rca基因表达情况为，42d前，两个基因的表达较强，而42d后，两基因的表达较弱红、蓝、紫膜处理叶片两基因的表达均较强；白膜和黄膜处理下，虽然rbc基因的表达也较强(特别是白膜的)，但rca基因的表达却很弱(特别是黄膜处理的)目前四十一页\总数四十七页\编于十五点第三部分结果小结：总体上，在不同光质处理下，红、蓝、紫膜，特别是红、蓝膜较白光更有利于烟叶的生长发育，而黄膜有“弱化”作用。这得益于红、蓝光处理提高了叶片光合作用效率，并且保持了较好的叶片组织结构疏松度博士学位论文答辩目前四十二页\总数四十七页\编于十五点结论渗透胁迫诱导烟草细胞NO的快速产生。外源NO供体SNP处理显著提高了烟草细胞的抗渗透胁迫能力，这是通过提高烟草细胞的渗透调节能力来实现的。NO可能主要通过调控脯氨酸代谢，进而提高胞内脯氨酸积累量使细胞增强渗透调节能力机械刺激能够诱导烟草细胞快速产生NO，(类)NOS催化的精氨酸依赖途径可能是机械刺激诱发烟草细胞NO产生的主要途径，Ca2+-钙调素可能通过调节(类)NOS活性来调控NO的产生不同光质对烟草叶片的生长发育、形态建成、组织结构、光合效率及相关的生化指标有显著影响，总体而言，红光和蓝光促进了烟叶的