LC的使用维护和应用

LC-5500的使用、维护及应用——液相色谱培训（五）目前一页\总数七十一页\编于十四点主要内容LC-5500高效液液相色谱仪的使用和维护液相色谱常见问题及其对策高效液相色谱的应用目前二页\总数七十一页\编于十四点LC-5500高效液相色谱的使用与维护目前三页\总数七十一页\编于十四点高液相色谱仪

——开机前的准备工作

●流动相和样品的前处理★过滤★脱气

目前四页\总数七十一页\编于十四点流动相的前处理：过滤设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、

0.45μm或更细的水性滤膜和有机滤膜过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵抽滤过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，

避免堵塞色谱柱和液路，

尤其是使用无机盐配制

的缓冲液目前五页\总数七十一页\编于十四点储液瓶一个存放流动相的容器储液瓶的材料应耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料（聚四氟乙烯），一般常用有机溶剂的原装瓶作为储液瓶用棕色玻璃瓶作为储液瓶，可避免藻类的生长为保持流动相的纯净，应经常清洗或更换储液瓶目前六页\总数七十一页\编于十四点流动相的前处理：脱气脱气的目的：使色谱泵的输液准确

输液均匀准确，且脉动减小。保留时间及色谱峰面积的重现性提高

提高检测的性能

防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低

保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化目前七页\总数七十一页\编于十四点常用的脱气方法氦气脱气法加热回流法抽真空脱气法超声脱气法在线真空脱气法目前八页\总数七十一页\编于十四点脱气机超声波清洗器目前九页\总数七十一页\编于十四点样品的前处理◆使用流动相溶解样品

--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要

--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀◆

样品需要过滤◆如果样品中有气泡，也要超声脱气目前十页\总数七十一页\编于十四点LC-5500液相色谱仪组成简图目前十一页\总数七十一页\编于十四点P101泵键盘目前十二页\总数七十一页\编于十四点单向阀结构抛光面透明塑料垫片宝石球单向阀原理吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头泵工作原理目前十三页\总数七十一页\编于十四点泵使用注意事项泵不能在没有溶剂时空转，否则活塞与泵缸的密封之间磨损会造成泄漏泵不能用具有腐蚀性的物质，pH使用范围为2～8.5含盐流动相使用后不能长期存放在泵中，随着液体的蒸发，留下的少量盐的晶体会磨损高压密封圈和泵塞，所以在应用含盐流动相后，一定要用纯水彻底清洗泵绝对不允许在大于最大允许压力限定值（40MPa）下操作目前十四页\总数七十一页\编于十四点LC-5500主机进样阀检测器电源柱箱电源调零旋钮柱温箱液晶显示屏目前十五页\总数七十一页\编于十四点进样方法1.在INJECT（进样）状态下清洗阀口

2.在LOAD（装填）状态下插入微量注射器

3.注入样品

4.切到INJECT（进样）状态目前十六页\总数七十一页\编于十四点进样注意事项●用注射器吸取样品后，一定要排除气泡后方可进样●将注射器针头插入进样口，直到针头顶住进样阀体平面为止，且不可用力过大，以免损伤阀体密封面●缓慢推进注射针，使定量管完全充满样液●旋转手柄时一定要快，否则对泵和柱子都会产生不良影响目前十七页\总数七十一页\编于十四点进样量和检测器响应的关系示意图进样体积检测器响应值定量环体积的一半2倍定量环体积全量注入部分注入目前十八页\总数七十一页\编于十四点进样阀的冲洗进完样后一定要及时冲洗进样阀，特别是用含盐缓冲液作流动相，由于这些溶液会形成结晶从而磨损垫圈将进样阀转至INJECT（进样）位置，利用液相泵冲洗定量环及沟槽，利用注射器冲洗进样阀的阀口；或将进样阀转至LOAD（装填）位置，利用注射器同时冲洗进样阀的阀口和定量环经常用湿润的软布清洁进样阀，特别是进样口周围目前十九页\总数七十一页\编于十四点进样阀使用注意事项阀应该保持在LOAD或INJECT中的一个位置。如果阀处在两者中间的位置，系统内的高压可能会破坏其密封表面

只允许用平端的冲洗注射器和样品注射器，绝对禁止用尖端（GC）注射器，以防划伤阀的密封面。目前二十页\总数七十一页\编于十四点柱温箱结构图柱箱门保护柱色谱柱接检测器目前二十一页\总数七十一页\编于十四点柱温箱的使用注意事项打开柱温箱电源开关，通过工作站软件设定柱箱温度使用柱恒温箱时，应先输入流动相然后再升温；关机时则相反，即先关闭升温电源，待色谱柱温度降至室温后方可停泵在常温下操作时，则不必打开柱温箱电源目前二十二页\总数七十一页\编于十四点色谱柱日常使用注意事项过滤所有的溶剂和样品使用保护柱不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液开机时，流速和柱压要逐渐增加注意色谱柱的pH值使用范围不要高压冲洗柱子不能让缓冲盐溶液留存在色谱柱中，关机前要先用含低浓度有机溶剂的水溶液冲洗，然后再用纯有机溶剂来保存柱子目前二十三页\总数七十一页\编于十四点色谱柱的更换对于反相色谱柱的更换：拆卸色谱柱时，必须先关断柱箱电源。待色谱柱柱温降到室温后，继续用溶剂如甲醇冲洗色谱柱约20min；先卸下色谱柱出口端接头，待有甲醇流出后再拧上螺帽；然后拧下色谱柱进口端接头，继续使甲醇滴入色谱柱，当柱进口端有甲醇溢出，且没有气泡时，表明色谱柱已被甲醇充满，此时可再拧上保护性螺帽。换新色谱柱的程序相反。目前二十四页\总数七十一页\编于十四点色谱柱更换、保存注意事项冲洗或活化色谱柱时，流出液应放入废液瓶中，千万不可接到检测器上，以免污染流通池按柱子进出口方向接入系统，不可更改色谱柱内应充满溶剂，绝不可干燥放置。正相柱用正己烷或乙腈，反相柱用甲醇用原配的柱端堵头封紧柱两端色谱柱存放时防止震动，以免损坏柱床目前二十五页\总数七十一页\编于十四点检测器的使用注意检测器的波长通过工作站的软件设定氘灯通电后在一分钟内起辉，然后进入工作状态，一般氘灯稳定需要0.5~1h，稳定后就可以进样分析，所以要等仪器达到稳定状态，也即基线走稳后方可进行样品分析注意液晶显示屏所显示的数字要为正，通过调零旋钮调节基线与零点的位置，使基线在零点的上方目前二十六页\总数七十一页\编于十四点工作站界面目前二十七页\总数七十一页\编于十四点整套液相色谱仪的维护1、在使用过含盐缓冲液后，用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）冲洗整个系统，时间为30min，流量1mL/min。本步骤主要是冲洗干净系统内含盐缓冲液。2、用纯的强溶剂（甲醇或乙腈）冲洗整个系统，时间为30min以上，流量为1mL/min。本步骤主要是保护色谱柱。3、如果未使用缓冲液，上面步骤1可免去，直接用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为30min以上，流量为1mL/min每次用过仪器后必须做!目前二十八页\总数七十一页\编于十四点注意事项流动相的选择：对样品易溶，且溶解度尽可能大化学性质稳定，不损坏柱子不妨碍检测器检测，所选波长处无吸收黏度低，流动性好无毒或低毒，易于操作易于制成高纯度，即色谱纯废液易处理，不污染环境目前二十九页\总数七十一页\编于十四点注意事项缓冲液的使用：使用前必须过滤使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:

用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）冲洗30min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min易受到细菌和霉菌的影响，最好是现用现配

不能直接用有机溶剂冲洗目前三十页\总数七十一页\编于十四点液相色谱常见问题及其对策目前三十一页\总数七十一页\编于十四点液相色谱常见问题类型A.压力异常（偏高、波动）

B.漏液

C.保留时间漂移

D.基线问题（漂移、噪声）

E.峰形异常目前三十二页\总数七十一页\编于十四点现象：无压力，流动相不流动可能原因：

1、柱塞杆折断

2、泵头内有空气或流动相不足

3、单向阀堵塞

4、漏液

5、压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)压力异常目前三十三页\总数七十一页\编于十四点现象：压力持续偏高或不断上升可能原因：

1、流速设定过高

2、保护柱或柱子筛板堵塞

3、流动相使用不当或有缓冲盐析出

4、色谱柱选择不当

5、进样阀损坏压力异常目前三十四页\总数七十一页\编于十四点现象：压力持续偏低可能原因：

1、流速设定过低

2、色谱柱选择不当

3、柱温过高

4、系统漏液压力异常目前三十五页\总数七十一页\编于十四点压力异常现象：压力波动可能原因：

1、泵头中有气泡

2、单向阀损坏

3、柱塞密封圈损坏

4、脱气不充分

5、系统漏液

6、使用了梯度洗脱目前三十六页\总数七十一页\编于十四点漏液接头处漏液

可能原因：

1、接头处松动

2、接头磨损

3、接头被污染

4、部件不匹配

目前三十七页\总数七十一页\编于十四点漏液泵漏液

可能原因：

1、单向阀松动

2、泵密封圈损坏

3、接头松动（不要拧的太紧）目前三十八页\总数七十一页\编于十四点进样阀漏液

可能原因：

1、转子密封损坏

2、定量环堵塞

3、进样口密封松动

4、进样针尺寸不合适

5、废液管产生虹吸

6、废液管堵塞漏液目前三十九页\总数七十一页\编于十四点检测器漏液

可能原因：

1、流通池破碎

2、废液管堵塞

3、流通池堵塞漏液目前四十页\总数七十一页\编于十四点保留时间漂移

可能原因：

1、柱温变化

2、流动相组分变化

3、色谱柱没有平衡好

4、流速变化

5、泵中有气泡

6、流动相选择不当

7、键合相流失保留时间漂移目前四十一页\总数七十一页\编于十四点基线漂移

可能原因：

1、温度波动

2、流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂)3、流通池被污染或有气泡

4、流通池窗口破裂

5、流动相配比不当或流速变化

6、色谱柱没有平衡

7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成

8、样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出

9、检测器没有设定在最大吸收波长处基线问题目前四十二页\总数七十一页\编于十四点基线噪声（规则的）

可能原因：

1、流动相、泵、检测器中有气泡

2、有地方漏液

3、流动相混和不均匀

4、温度影响（检测器和柱温差别太大）

5、其他电子设备的影响

基线问题目前四十三页\总数七十一页\编于十四点基线噪声（不规则的）

可能原因：

1、流动相污染、变质或由低质溶剂配成

2、有地方漏液

3、流动相各溶剂不相溶或混和不均匀

4、流通池污染

5、系统内有气泡基线问题目前四十四页\总数七十一页\编于十四点前沿峰、拖尾峰

可能原因：

1、柱塞板堵塞

2、色谱柱塌陷

3、柱外效应

4、干扰峰

5、重金属污染

6、样品溶剂选择不当

7、样品过载

8、柱温过低峰形异常目前四十五页\总数七十一页\编于十四点峰分叉

可能原因：

1、保护柱或分析柱污染

2、样品溶剂不溶于流动相峰形异常目前四十六页\总数七十一页\编于十四点峰展宽可能原因：1、进样体积过大2、流动相粘度过高3、保留时间过长4、柱外体积过大5、样品过载峰形异常目前四十七页\总数七十一页\编于十四点峰变形

可能原因：

1、样品过载

2、样品溶剂选择不当峰形异常目前四十八页\总数七十一页\编于十四点峰形异常鬼峰可能原因：1、进样阀残余峰2、样品中未知物3、柱未平衡4、水污染目前四十九页\总数七十一页\编于十四点高效液相色谱的应用目前五十页\总数七十一页\编于十四点在食品分析中的应用食品营养成分分析：氨基酸、色素、维生素、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）等食品添加剂分析：甜味剂（安塞蜜、糖精钠）、防腐剂（山梨酸、苯甲酸）、合成着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等食品中控制使用或禁止使用添加物的分析：过氧化苯甲酰、苏丹红、三聚氰胺目前五十一页\总数七十一页\编于十四点食品中苯甲酸、山梨酸的测定

—GB/T5009.29-2003色谱条件：色谱柱：C18柱，4.6mm×250mm，10μm不锈钢柱或性能相当者流动相：甲醇：0.02mol/L乙酸铵溶液＝5：95流速：1mL/min进样量：20μL柱温：室温检测波长：230nm目前五十二页\总数七十一页\编于十四点苯甲酸、山梨酸和糖精钠色谱图目前五十三页\总数七十一页\编于十四点食品中合成着色剂的测定

－GB/T5009.35-2003色谱条件：色谱柱：C18柱，4.6mm×250mm，10μm不锈钢柱或性能相当者流动相：A：甲醇；B：0.02mol/L乙酸铵溶液梯度洗脱：甲醇：20％～35％，3％/min；35％～98％，9％/min；98％继续6min流速：1mL/min进样量：20μL柱温：室温检测波长：254nm目前五十四页\总数七十一页\编于十四点柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝色谱图目前五十五页\总数七十一页\编于十四点小麦粉中过氧化苯甲酰的测定

高效液相色谱法

－GB/T22325-2008色谱条件：色谱柱：C18反相柱（4.6mm×250mm，5μm）或性能相当者流动相：甲醇：0.02mol/L乙酸铵溶液＝10：90流速：1mL/min进样量：20μL柱温：室温检测波长：230nm目前五十六页\总数七十一页\编于十四点过氧化苯甲酰色谱图目前五十七页\总数七十一页\编于十四点食品中苏丹红染料的检测方法

高效液相色谱法

－GB/T19681-2005色谱条件：色谱柱：C18反相柱（4.6mm×250mm，5μm）或性能相当者流动相：A：0.1％甲酸的水溶液：乙腈＝85：15B：0.1％甲酸的乙腈溶液：丙酮＝80：20梯度洗脱：见表流速：1mL/min进样量：20μL柱温：30℃检测波长：苏丹红Ⅰ478nm，苏丹红Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ520nm目前五十八页\总数七十一页\编于十四点梯度洗脱表目前五十九页\总数七十一页\编于十四点苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ色谱图目前六十页\总数七十一页\编于十四点原料乳与乳制品中三聚氰胺检测

－GB/T22388-2008色谱条件：色谱柱：C8反相柱（4.6mm×250mm，5μm）或性能相当者流动相：缓冲液：乙腈＝85：15（缓冲液为：2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，调pH至3.0后，定容为1L）流速：1mL/min进样量：20μL柱温：30℃检测波长：240nm目前六十一页\总数七十一页\编于十四点三聚氰胺色谱图目前六十二页\总数七十一页\编于十四点原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法

——GB/T22400-2008色谱条件：色谱柱：强阳离子交换柱，SCX（4.6mm×250mm，5μm）或性能相当者流动相：磷酸盐缓冲液：乙腈＝70：30（缓冲液为：6.8g磷酸二氢钾，加入约800mL水溶解，用磷酸调pH至3.0后，定容为1L）流速：1.5mL/min进样量：20μL柱温：室温检测波长：240nm目前六十三页\总数七