中药指纹图谱研究

中药指纹图谱研究概况湖北中医学院药学院干国平博士2009.11第一页，共五十六页。引言

中药指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式，其研究的方法和技术日趋成熟完善，是目前控制中药和天然药质量最有效的方法和手段之一。

中药指纹图谱能从原药材的栽培、引种，中成药生产工艺的规范与优化，到产品质量标准的制定提供全方位的质量保证。第二页，共五十六页。引言日本汉方药在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制。美国食品药品管理局允许草药保健品申报资料时提供色谱指纹图。世界卫生组织在1996年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图以证明产品质量的一致性。第三页，共五十六页。

1.我国研究中药指纹图谱的历史

20世纪70年代：我国的学者尝试用UV、IR、TLC、GC进行中药的鉴别研究；

第四页，共五十六页。

1.我国研究中药指纹图谱的历史

20世纪80年代~90年代：《中国药典》1995年版一部收载了TLC法鉴别中药材及中成药。《中国药典》2000年版一部中药薄层色谱鉴别引进了“对照药材”，以完整的色谱图像作为鉴别的依据而正式纳入国家药品标准。《中国药典》2005年版一部HPLC、GC广泛用于中药的定性、定量分析

第五页，共五十六页。1.我国研究中药指纹图谱的历史痔疮栓中黄柏的TLC鉴别1.阴性对照2.样品3.黄柏对照药材第六页，共五十六页。

逍遥丸中甘草的鉴别（1.阴性对照、2.样品3.对照药材）

123甘草的来源：甘草GlycyrrhizauralensisFisch.胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根茎第七页，共五十六页。1.中药指纹图谱的历史2000年:

国家药监局颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》。国家从行政管理的角度，正式要求已注册的中药注射剂须进行指纹图谱研究和纳入质量标准；规范了中药指纹图谱的研究，从而促进了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。第八页，共五十六页。2.中药指纹图谱的定义定义：

运用现代分析技术对中药化学信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述。现代分析技术：TLC、TLCS、HPLC、HPLC-MS、GC、GC-MS、HPCE、IR、NMR、X-射线衍射、DNA指纹图谱等。主要是色谱技术。第九页，共五十六页。2.中药指纹图谱的定义表征和描述：“表征”是将中药化学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表达；“描述”是对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。分析比较的结果，是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出评价。第十页，共五十六页。3.建立中药指纹图谱的目的和意义中药的特点：（1）中药化学成分的多样性与复杂性；（2）中药药效成分的非单一性；（3）中药质量的不稳定性。

第十一页，共五十六页。3.建立中药指纹图谱的目的和意义

（1）对中药质量控制的补充和提高：现有质量控制模式：以1个或1个以上成分为控制指标，难以准确、全面地评价中药质量。指纹图谱从整体上评价中药的内在质量，已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。第十二页，共五十六页。3.中药指纹图谱的研究目的意义

（2）提高中药质量的稳定性

控制原料、中间体、成品的一致性，减少批间差异，提高中药质量的稳定性。第十三页，共五十六页。

（1）系统性：尽可能多的覆盖全貌。指纹图谱反映的化学成分应包括中药有效所部位所含大部分成份的种类，或指标成分的全部。4.中药指纹图谱建立的原则第十四页，共五十六页。

（2）特征性：特征明显，专属性强。指纹图谱中反映的化学成分信息应具有高度的选择性，这些信息的综合结果，将能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的化学条码。4.中药指纹图谱建立的原则第十五页，共五十六页。

（3）重现性：重现性好。重现性是保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性的前提。4.中药指纹图谱建立的原则第十六页，共五十六页。菝葜抗肿瘤活性部位指纹图谱的研究1.药材来源2.色谱条件3.供试品和对照品溶液的制备4.方法学考察5.指纹图谱及技术参数第十七页，共五十六页。1.药材来源（10种菝葜、4种近缘品种）样品编号药材产地来源1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.2湖南靖州菝葜S.chinaL.3安徽坟天山菝葜S.chinaL.4广西宾阳菝葜S.chinaL.5广东省从化县菝葜S.chinaL.6重庆市马脚山菝葜S.chinaL.7浙江温州市永嘉县上塘镇菝葜S.chinaL.8福建仙游菝葜S.chinaL.9湖南岳阳菝葜S.chinaL.10江西樟树市让山菝葜S.chinaL.

11江西弋阳小果菝葜（S.davidianaA.DC）12湖南长沙长托菝葜（S.feroxWall.exKunth）13湖北麻城黑果菝葜(S.glauco-chinaWarb.)14湖北咸宁土茯苓(S.glabraRoxb.)第十八页，共五十六页。2.色谱条件：

KromasilC18柱（4.6×250mm，5μm）流速:0.8ml·min-1进样量:20μL；检测波长:330mm；流动相:乙腈-甲醇-0.04％磷酸溶液

梯度洗脱程序（V/V,%）

时间（min）乙腈甲醇0.04％磷酸溶液01038730123853217380601837910028369第十九页，共五十六页。3.供试品溶液的制备

样品粉末70％乙醇超声提取滤过，取续滤液蒸干残渣热水溶解乙酸乙酯萃取乙酸乙酯液甲醇定容微孔滤膜滤过蒸干残渣供试品溶液4.对照品溶液的制备

精密称取黄杞苷对照品适量，加甲醇制成每ml含50μg的溶液。

第二十页，共五十六页。5.1精密度试验5.2稳定性试验5.3重现性试验5.方法学考察第二十一页，共五十六页。精密度和稳定性试验结果（相对保留时间）(n=5)峰号⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.2750.2760.2730.2730.2750.2740.4920.3940.3960.3960.3930.3960.3950.3630.4880.490.4910.4860.490.4890.4140.8010.8040.8030.80.8020.8020.2050.8520.8550.8550.8520.8530.8530.1860.9200.920.9180.9190.9210.9200.127（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0081.2691.2651.2551.2681.2711.2660.5091.3421.3531.3551.3531.3481.3500.39101.7111.7081.6961.7071.7011.7050.35111.7771.7831.7861.7821.7781.7810.21121.8251.8311.8351.8291.8251.8290.23第二十二页，共五十六页。精密度和稳定性试验结果（相对峰面积）(n=5)峰号⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD（％）10.7500.7570.7750.7730.7840.7681.8120.1770.1760.1690.1750.1760.1751.8430.3590.3590.3620.3590.3600.3600.3640.2310.2330.2200.2250.2340.2292.6050.2280.2210.2210.2240.2260.2241.3861.4531.4611.4321.4621.4881.4591.387（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0087.8627.8567.8407.8417.8407.8480.1390.2540.2570.2540.2550.2530.2550.60101.2701.2741.2721.2741.2741.2730.14110.2980.2910.2900.2940.2960.2941.14120.5780.5780.5740.5780.5770.5770.30第二十三页，共五十六页。精密度与稳定性试验结果：

☆各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％;☆仪器的精密度良好；☆供试品溶液在12h内基本稳定；

第二十四页，共五十六页。重现性试验结果（相对保留时间）(n=5)峰号⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.2750.2760.2750.2730.2780.2750.6620.3940.3960.3960.3960.3940.3950.2830.4880.490.490.4910.4890.4900.2340.8010.8030.8020.8030.8030.8020.1150.8520.8550.8550.8530.8520.8530.1860.920.9190.920.9210.920.9200.087（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0081.2691.2641.2651.2651.2651.2660.1591.3421.3531.3551.3531.3481.3500.39101.7111.7061.7061.7061.7061.7070.13111.7771.7821.7781.7811.7821.7800.13121.8251.831.831.8311.8311.8290.14第二十五页，共五十六页。重现性试验结果（相对峰面积）(n=5)峰号⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.750.7590.760.7630.7740.7611.1420.1770.1750.1790.1770.1770.1770.8030.3590.360.3590.3620.3590.3600.3640.2310.2230.220.2240.2240.2241.8050.2280.2240.2210.2270.220.2241.5861.4531.4611.4571.4591.4621.4580.257(S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0087.8627.8557.867.8497.8457.8540.0990.2540.2540.2560.2550.2530.2540.45101.271.2741.2721.2741.2731.2730.13110.2980.2930.290.2890.2970.2931.38120.5780.5750.5790.5780.5780.5780.26第二十六页，共五十六页。重现性试验结果：

☆

各共有峰相对保留时间的RSD均小于3％；☆各共有峰相对峰面积的RSD均小于3％；

☆表明方法的重现性好。

第二十七页，共五十六页。6.指纹图谱及技术参数6.1指纹图谱的制备6.2共有指纹峰的标定6.3共有指纹峰面积的比值6.4非共有峰面积的比值6.5主要指纹峰的归属6.6相似度分析第二十八页，共五十六页。6.1指纹图谱的制备

分别精密吸取供试品溶液（10批菝葜正品及4批菝葜近源品种）各20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录90min内色谱图第二十九页，共五十六页。10批菝葜指纹图谱叠加图第三十页，共五十六页。6.2共有指纹峰的标定

以相对保留时间标定了12个共有峰S第三十一页，共五十六页。

6.2共有指纹峰的标定

(共有峰相对保留时间)峰号样品1234567(S)8910111210.2750.3940.4880.8010.8520.9201.0001.2691.3421.7111.7771.82520.2760.3980.4880.8000.8380.9191.0001.2721.3461.7081.7731.82030.2760.3950.4890.8040.8540.9241.0001.2761.3431.7101.7691.81640.2770.3940.490.8020.8520.9241.0001.2791.3451.7101.8061.82450.2750.3950.4890.8040.8530.9211.0001.2711.3381.6991.7671.81560.2760.3920.4710.7740.8560.9181.0001.2701.3411.6941.7681.79170.2740.3950.4850.8000.8520.9181.0001.2651.3321.6941.7681.79180.2770.3960.4890.7990.8500.9191.0001.2721.3401.7021.7691.81690.2730.3940.4850.8000.8490.9191.0001.2711.3421.7101.7741.805100.2760.3970.4900.8010.8380.9191.0001.2701.3381.7041.7681.817平均值0.2760.3950.4860.7990.8490.9201.0001.2721.3411.7041.7741.812RSD(％)0.460.021.331.051.380.99011.081.091.371.27符合指纹图谱的要求第三十二页，共五十六页。6.3共有指纹峰面积的比值（以参照峰S的峰面积为1计算）峰号样品1234567(S)8910111210.7500.1770.3590.2310.2281.4531.0007.8620.2541.2700.2980.57821.1791.4270.5271.3921.0901.8091.0007.9341.0211.6681.0090.51430.7820.1310.1650.3000.0851.0891.0006.2900.2050.4820.1430.18541.1600.2431.0750.6301.8051.8011.0007.9110.2870.7890.9820.25250.1980.8150.2030.3800.7211.0441.0006.2950.2960.6030.3380.07061.3931.6601.2961.8320.5861.8121.0006.3170.2372.7041.0880.62371.2842.4331.7551.3242.0151.4771.0006.2990.9442.6810.7970.96781.0100.3361.8690.6611.6271.4571.0006.8670.5881.0330.5610.32290.8050.2761.6510.9340.4271.7911.0009.3810.5291.7770.2280.462102.5041.3192.6251.1501.9831.2161.0009.2850.8992.3311.0250.323峰面积占总峰面积大于20％，其差值不大于±20％峰面积占总峰面积大于10％，而小于20％，其差值不大于±25％符合指纹图谱的要求第三十三页，共五十六页。6.4非共有峰峰面积的比值

样品编号非共有峰面积总峰面积比例（％）17722.52657452.91220932.81.8831099.9530092.0741575.31148171.3751458.8443423.2961338.21031741.2973580.51271932.8182254.71310091.7291309.6779991.68101171.1423102.77非共有峰占总峰面积的比值均小于5％符合指纹图谱的技术要求

第三十四页，共五十六页。6.5共有峰的归属

水飞蓟宾13.0min氧化白藜芦醇

43.6min黄杞苷47.5min白藜芦醇60.0min第三十五页，共五十六页。6.6指纹图谱的相似度

样品编号药材产地来源相似度（％）1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.1002湖南靖州菝葜S.chinaL.99.53安徽坟天山菝葜S.chinaL.90.74广西宾阳菝葜S.chinaL.91.35广东省从化县菝葜S.chinaL.89.06重庆市马脚山菝葜S.chinaL.91.97温州永嘉县上塘镇菝葜S.chinaL.94.08福建仙游菝葜S.chinaL.94.79湖南岳阳菝葜S.chinaL.91.810江西樟树市让山菝葜S.chinaL.

87.4第三十六页，共五十六页。6.6指纹图谱的相似度

样品编号药材产地来源相似度(％))1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.10011江西弋阳小果菝葜（S.davidianaA.DC）71.512湖南长沙长托菝葜（S.feroxWall.exKunth）67.913湖北麻城黑果菝葜(S.glauco-chinaWarb.)70.014湖北咸宁土茯苓(S.glabraRoxb.)65.14种近缘品种指纹图谱的相似度均在75%以下第三十七页，共五十六页。菝葜与四种近缘品种的指纹图谱比较

菝葜小果菝葜长托菝葜黑果菝葜土茯苓第三十八页，共五十六页。1.不同产地菝葜的指纹图谱间有一定的差异，反映了菝葜药材质量的不稳定性。主要表现在：

（1）品种相同、产地不同的药材化学成分基本相同，但含量相差较大；（2）菝葜与其近缘品种间的化学成分及含量均相差较大2.正品和近缘品种指纹图谱的相似度差异较大，表明研究和制定菝葜药材的指纹图谱，对控制其药材质量具有重要意义。

讨论第三十九页，共五十六页。6.中药指纹图谱发展的阶段性中药指纹图谱的发展可分为：初级阶段高级阶段：

第四十页，共五十六页。6.中药指纹图谱发展的阶段性（1）初级阶段

确立指纹图谱的建立方法及相似度判定。中药注射剂起效快，疗效好，化学成分相对其他中药来说要少得多，但对其产品质量要求又比其他中药制剂更高，选择中药注射剂,开展制订其指纹图谱工作具有很强的可行性。第四十一页，共五十六页。5.中药指纹图谱已取得的成果（1）中药质量控制和评价模式的转变：开始由单一指标成分的鉴别及含量测定为平台向以多组分相互依存的化学分布模式的整体模式——“指纹图谱”模式为平台的递进，即由“点”向“面”递进。第四十二页，共五十六页。5.中药指纹图谱已取得的成果指纹图谱在一定程度上将中药的化学成分以色谱整体为特征展现出来，先构建一个“灰色质量信息库”，供我们逐步揭示其化学组成，以及成分分布和相互比例的关系，逐步减低其“灰度”，提高“透明度”，让我们看的越来越清楚，减少客观存在的不确定性（模糊性），提高稳定性。力求从整体的视角把现代科技研究的与质量有关的数据和信息与中医药传统经验相结合。

第四十三页，共五十六页。5.中药指纹图谱已取得的成果（2）中药指纹图谱实验研究技术逐渐成熟：中药指纹图谱实验研究技术已有初步的规范化要求；指纹图谱的实验研究与市场产品的结合进入了实用的初级阶段。第四十四页，共五十六页。5.中药指纹图谱已取得的成果（3）化学计量学的渗透，迅速取得初步成效，并开发出相应的计算机软件：a.相似度评价法b.模糊聚类分析法c.人工神经网络法d.主成分分析法

化学计量学在指纹图谱研究和应用中的结合逐渐向纵深发展，促进化学计量学迫切地向“草根问题”实用研究发展。第四十五页，共五十六页。5.中药指纹图谱已取得的成果（4）74种注册中药注射剂指纹图谱研究结合生产实际取得确凿的成果：不少品种通过指纹图谱的研究，进一步规范了生产工艺、提高了产品质量，并通过了技术鉴定，如获批准为质量标准的内容，将对规范和监管药品的质量稳定和一致起到肯定作用，对普遍提升中药产品质量起到示范作用。第四十六页，共五十六页。5.中药指纹图谱已取得的成果（5）指纹图谱技术得到全国范围的普及，有关高等院校及科研机构普遍列入科研选题，论文数量飚升，促进了色谱技术的迅速提高。第四十七页，共五十六页。5.中药指纹图谱已取得的成果（6）企业对药品质量意识的提高：

指纹图谱技术不仅已应用于中药注射剂的质量控制，而且也促使某些企业意识到药品市场由商业运作取胜必将逐渐转向以内在质量取胜，由行政保护逐渐转变为依靠自身技术提高保护，而开始自觉和主动地对自己的主要产品进行指纹图谱研究。第四十八页，共五十六页。6.中药指纹图谱发展的阶段性存在的问题：

（1）指纹图谱的研究集中在药材，对复方的研究不多如何挖掘复方中药的质量信息需要更多的研究。结合体内药物代谢的研究，更需要细致地研究中药成分分布的整体特征以