细菌内毒素检查法

中药制剂分析技术细菌内毒素检查法ShandongCollegeofTraditionalChineseMedicine一、基本概念1.细菌内毒素（Endotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由脂多糖组成。

2.细菌内毒素检查法系指利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。细菌内毒素检查法二、检查方法包括凝胶法和光度测定法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。是中国药典的“仲裁”方法。光度测定法后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来定量测定内毒素。细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法三、仪器和试剂（一）仪器和试剂

37±1℃恒温水浴或适宜的恒温器具、超净工作台、漩涡混合器、内毒素工作标准品、加样器、鲎试剂、鲎试验用水、pH调节剂等。鲎试剂漩涡混合器加样器器具要求：凡与供试品或试剂直接接触的器具必须经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上)去除，也可采用其他适宜方法。（二）仪器和试剂的相关要求鲎试验用水：凝胶法：内毒素含量小于0.015EU／ml光度测定法：内毒素含量小于0.005EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。细菌内毒素检查法

细菌内毒素国家标准品：系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。细菌内毒素检查法三、测定方法供试品确定限值确定最大有效稀释倍数（MVD）供试品干扰实验正式实验结果判断检验流程细菌内毒素检查法供试品内毒素检查：凝胶限度试验编号内毒素浓度／被加入内毒素的溶液平行管数A无／供试品溶液2B2λ／供试品溶液2C2λ／检查用水2D无／检查用水2A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml)。细菌内毒素检查法1．溶液制备（1）供试品溶液制备：用细菌内毒素检查用水将供试品配成对应的MVD的浓度A。（2）供试品阳性对照液的制备：

用被测供试品溶液A将细菌内毒素工作标准品制成2λ浓度的内毒素溶液B。（3）阳性对照液的制备：用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品制成2λ浓度的内毒素溶液C。（4）阴性对照液：细菌内毒素检查用水D细菌内毒素检查法

MVD的确定和2λ浓度的细菌内毒素溶液的制备。

最大有效稀释倍数（MVD）是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。MVD=cL/λ

式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）难点释疑细菌内毒素检查法1．细菌内毒素（Endotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由脂多糖组成。

2．细菌内毒素检查法主要有凝胶法和光度测定法两