微生物实验放线菌

放线菌的分离纯化、鉴别与培养实验生物科学1101班第二小组引言

土壤是微生物的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

放线菌广泛分布在含水量较低，有机物较丰富和呈微碱性的土壤中，泥土所特有的泥腥味，主要是由放线菌产生的土腥味素所引起的，研究发现，骆驼寻找水源的主要线索就是嗅到土腥味素。每克土壤中放线菌的孢子数一般可达百万左右。实验目的

1、通过代表微生物放线菌的学习来掌握选育、分离纯化和培养微生物等的基本操作技术。

2、深入了解放线菌的形态特征。

3、复习回顾微生物实验的各种技术及方法（培养基的制备，消毒与灭菌，革兰氏染色法，无菌操作技术等）。

实验原理（结合《微生物学实验》中实验五《平板分离技术与活菌计数》）

1、菌体培养：选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

马丁氏培养基（PDA培养基）：培养真菌（加入青霉素和链霉素，制成抗细菌的双抗培养基）高氏1号培养基：培养放线菌（加入10％酚数滴）

2、微生物的分离与纯化：从杂菌混生的微生物群体中获得只含有一种或某一株微生物的过程。

3、微生物在固体培养基上形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法是平板分离法，此法主要有：①平板划线分离法；②稀释涂布平板法。后者除能分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数量。

4、放线菌主要是呈丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌。实验思路

将采集来的土壤样品制成悬浮液，在悬浮液中获取不同稀释度的菌液，分别在高氏1号培养基上进行恒温培养，待菌苔长出后，挑取少许菌苔观察其形态，并将其细胞进行革兰氏染色后用显微镜检查是否为单一的微生物细胞，如若发现有杂菌，则须再次进行分离纯化。实验仪器和用具显微镜、擦镜纸、双层瓶、载玻片、盖玻片、镊子、无菌吸管、玻璃珠、无菌培养皿、恒温培养箱等。实验操作

1、稀释涂布平板法⑴倒平板⑵制备土壤稀释液⑶涂布取菌液0.1ml放入已写好稀释度的平板中，静置5~10min，使菌液吸附近培养基，用无菌的玻璃涂布器将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使均匀分布，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。⑷培养放线菌、真菌，28℃培养3~5天；细菌，37℃培养2~3天⑸挑菌苔将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基的斜面上，进行培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将微生物细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物，若发现杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。2、平板划线分离法（1）倒平板标明培养基名称、土样编号和实验日期。（2）划线用无菌的接种环挑取上述10-1倍的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采取哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，培养后能形成单个菌落。本实验采取四区划线法。常见的几种划线方法⑶挑菌苔

将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基的斜面上，培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将微生物细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物，若发现杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。(4)革兰氏染色鉴别

将挑出的菌苔进行革兰氏染色，依次进行初染、媒染、脱色、复染后进行镜检，由于放线菌是革兰氏阳性菌，所以染色后的菌体会呈现红色。

脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性色。所以要严格控制脱色的时间，保证染色成功。1、质地:致密、干燥、多皱、小而不蔓延、不易挑起，表面有放射状沟纹。2、菌落表面呈干粉状。3、菌体多产脂溶性或水溶性色素。放线菌形态观察放线菌菌丝的各种形态插片法使放线菌沿培养基与盖玻片交界处生长并附着于盖玻片上。(5)利用插片法培养放线菌实验注意事项

1、实验要在严格的无菌环境下进行，以避免杂菌感染；

2、涂片时取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免贪多造成菌体堆积而难以看清细胞个体形态。同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞；

3、涂布均匀，培养后菌落在整个平板表面分散均匀；

4、平板划线时要快速，接种针在平板上迅速滑动。s思考题1、放线菌与细菌菌落最显著的差异是什么？2、为什么要在高氏1号培养基中加入10%的酚？解答1、答：放线菌菌落的特征是：小型、干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一薄层彩色的“干粉”；菌落和培养基的连接紧密，难以挑取；菌落的正反面