开题报告修改02常黎明

冬虫夏草子座发育前后转录组基因文库的构建以及表达差异的研究专业：微生物学导师：谢放副教授姓名：常黎明1、转录组的特点及意义What？Why？How？转录组是指在某一生理条件下某物种产生的所有转录本的集合。广义的转录组主要包括信使RNA（mRNA）、非编码RNA、转运RNA（tRNA）及核糖体RNA（rRNA）。狭义的转录组主要指信使RNA（mRNA）。与基因组是的静态不同，转录组可以随物种自身发育或外部环境条件的变化而有所转变，同一物种在不同发育阶段或不同环境中其基因表达情况存在很大差异，具有很强的时间和空间特性。转录水平的变化是生物基因组与外部物理特征的动态联系，可反映生物个体在某一发育或生理阶段所有基因的表达水平。因此，掌握了特定生物转录水平的变化，就可以深入了解其生命活动特征和调控机制。转录组学研究内容主要包括以下几个方面：新基因的预测基因结构分析（SNP分析、转录组中存在的可变剪接分析、基因结构优化等）物种差异表达基因注释和富集分析差异表达基因表达蛋白的二级结构预测UTR（untranslatedregion）分析2、研究背景

冬虫夏草是由冬虫夏草菌侵染青藏高原高山草甸土中的鳞翅目蝙蝠蛾（主要为钩蝠蛾属ThitarodesViette）幼虫并在虫体内生长产生子座而形成的幼虫尸体与真菌的复合体。

作为一种未能实现人工化栽培的名贵药用真菌，冬虫夏草相关的研究都只是集中在菌种的分离鉴定、寄主昆虫种类的确定和人工繁殖、菌株培养特性、代谢产物分离分析及活性成分药理作用、冬虫夏草菌有性发育及其相关基因的研究等方面。特别对于冬虫夏草菌有性发育及其相关基因的研究一直是近年来国内为研究的热点。2、研究背景

由于冬虫夏草菌特殊的生境和本身的复杂性导致对其系统全面的研究面临困难，因而让其在人工条件下长出子座遇到巨大的挑战，况且到底哪种或哪几种菌是其正确的无性型学界众说风云。因此对于冬虫夏草子座有性发育的研究一般都停留在天然冬虫夏草的研究。冬虫夏草菌能够长出子座完成有性生殖过程说明它的基因组中的某些基因一定发生着时空表达，到底是某些基因的表达量的变化引起了有性生殖还是冬虫夏草菌生长到某一个阶段后一些基因在时间或空间的诱导下突然表达亦或是二者共同作用；这一有性发育过程中受到哪些因素的影响以及怎样的影响到目前都没有确定的答案。3、目的和意义通过对冬虫夏草子座发育前后转录组基因文库的表达差异研究旨在：（1）构建冬虫夏草长出子座的实验体系；（2）从分子层面揭示冬虫夏草子座发育的原因；（3）用生物信息学的方式预测冬虫夏草有性生殖的关键基因；（4）发掘冬虫夏草有性发育过程中未注释的基因区和新的转录本；（5）通过对子座发育前后差异表达基因以及转录本的功能注释和功能富集分析，为后续的生物信息学研究提供分子水平的依据。4、实验流程冬虫夏草菌的活化

批量接种菌种营养生长培养处理组：低温诱导使其进入子实体发育阶段末端修复、3’端加Poly（A）连接接头取样样品总RNA的提取及纯度检测对照组：保持营养生长SMARTcDNALibraryConstructionKit试剂盒构建cDNA文库PCR富集文库质控上机测序获得原始测序数据4.1、样品培养和获取将保藏的以前长出过子座的菌种经活化后重新接种到锥形瓶在培养箱中培养，经过2-3个月开始低温诱导使其长出子座。在无菌环境中以子实体发育启动前正常营养生长的菌落和萌发一周左右的子实体原基作为对照组，用手术刀小心切取菌落。各3个生物学重复。4.2、提取总RNA用RNA提取试剂盒提取TotalRNA，并进行样品的纯度、浓度和完整性检测，以保证使用合格的样品进行转录组测序。4、实验流程4.3、

mRNA的富集以及cDNA文库的构建

将上述检测合格后的总RNA用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，接着以mRNA为模板用SMARTcDNALibraryConstructionKit试剂盒构建高质量的cDNA文库，并进行末端修复、3’端加Poly（A）和加上连接接头，然后将cDNA文库进行PCR富集，最后通过QIAquickPCRPurificationKit试剂盒纯化纯化PCR产物，取一部分保存到-80℃保藏。

文库构建完成后，分别使用Qubit2.0和Agilent2100对文库的浓度和InsertSize进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。4、实验流程4.4、上机测序库检合格后，用HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE100。最后获得转录组的原始数据（RawData），每个测序样品的RawData包括两个FASTQ文件，分别包含所有cDNA片段两端测定的Reads。4、实验流程

对RawData进行数据过滤，去除其中的接头序列及低质量reads获得高质量的CleanData。

将CleanData与指定的参考基因组进行序列比对，获得MappedData。基于MappedData，进行插入片段长度检验、随机性检验等测序文库质量评估；进行表达量分析、可变剪接分析、新基因发掘和基因结构优化等基础分析。根据基因在不同样品或不同样品组中的表达量进行差异表达分析、差异表达基因功能注释和功能富集等高级分析。5、生物信息学分析测序数据质量控制与玉米赤霉基因组比对转录组文库质量评估差异表达基因富集分析（GO、KEEG富集分析）基因表达量分析表达大差异分析基因结构分析差异表达基因注释生物信息学分析流程图新基因分析差异表达基因蛋白互作网络分析差异表达基因功能注释（GO、COG、KEEG）重复相关性分析差异表达基因聚类分析差异表达基因筛选可变剪接预测基因结构优化SNP分析6、预期成果建立在人工培养基上长出冬虫夏草子座的实验体系；对冬虫夏草子座发育前后的转录组基因文库分别进行测序；运用生物信息学对上述所得数据进行深度分析；找到冬虫夏草子座发育前后转录本的表达差异以及子座发育的启动基因；运用生物信息学对冬虫夏草子座启动基因表达的蛋白质进行结构和功能的预测；发表1-2篇学术论文；完成学位论文。7、进度安排2015.08-2015.10查阅文献和书籍2015.10-2015.11菌种活化和培养撰写开题报告2015.12-2016.01提取子实体发育启动前正常营养生长菌落的mRNA并送

基因公司进行高通量测序2016.02-2016.04提取子实体原基发育期的mRNA并送基因公司高通量测序2016.05-2016.08获得两次样品的序列数据2016.9-2016.12对测序获得的数据进行深度的生物信息学挖掘2017.1-2017.3撰写学位论文8、可行性分析

本实验所用到的测序技术和生物信息学方法比较成熟，前人已经做过大量野生冬虫夏草菌和其他物种的cDNA文库的构建和生物信息学分析；前人在其他真菌子实体发育机制的研究取得了一定进