DNA甲基化检测方法演示文稿

DNA甲基化检测方法演示文稿目前一页\总数七十二页\编于十二点DNA甲基化检测方法总览目前二页\总数七十二页\编于十二点

主要检测途径基于重亚硫酸盐转化的方法(金标准)不基于重亚硫酸盐转化的方法目前三页\总数七十二页\编于十二点基于重亚硫酸盐转化的方法质谱分析水解核苷酸质谱分析目前四页\总数七十二页\编于十二点基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理1目前五页\总数七十二页\编于十二点基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理2目前六页\总数七十二页\编于十二点

应用一:直接测序法（Directsequencing)

用于甲基化分析的样本常常是混合样本，不适合直接直接进行sanger测序分析目前七页\总数七十二页\编于十二点

直接测序法目前八页\总数七十二页\编于十二点图6PMVK基因扩增产物反向测序结果目前九页\总数七十二页\编于十二点图7TRIB3基因扩增产物正向测序结果目前十页\总数七十二页\编于十二点应用二：重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequencePCR，BSP)目前十一页\总数七十二页\编于十二点目前十二页\总数七十二页\编于十二点

注：A：癌组织；B：癌旁组织；○­：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆测序结果目前十三页\总数七十二页\编于十二点BSP克隆测序甲基化率三维图形目前十四页\总数七十二页\编于十二点优点:能准确的检测出每个DNA分子单倍体型的

甲基化状态，同时能分析不同CpG位点之间

的甲基化状态的联系。缺点：需要对PCR产物克隆，操作繁琐，费时费

力，克隆子的数目影响结果的准确性。

测序重复性差。目前十五页\总数七十二页\编于十二点应用三：甲基化特异性PCR(methylafion-specificPCR，MS-PCR)目前十六页\总数七十二页\编于十二点目前十七页\总数七十二页\编于十二点目前十八页\总数七十二页\编于十二点UMUMUMladder100150200250MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化图MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。目前十九页\总数七十二页\编于十二点

MSP扩增产物凝胶电泳图研究结果注：M表示甲基化，U表示未甲基化

B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5为正常对照组五例标本；H2O为阴性对照；m为50bpMarker。SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态目前二十页\总数七十二页\编于十二点甲基化特异性PCR优点：①操作简便；②敏感性高；③Nested-MSP提高灵敏度，便于分析微量检材缺点：①引物设计要求高；②只能作定性研究；③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性；④只能了解部分位点的甲基化状态。目前二十一页\总数七十二页\编于十二点MethyLight对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而实现甲基化的定量分析。优点：增加了重亚硫酸盐转化和DNA复性的质控对照

避免了电泳、酶切等操作缺点：PCRbias目前二十二页\总数七十二页\编于十二点应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)目前二十三页\总数七十二页\编于十二点结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法目前二十四页\总数七十二页\编于十二点基于限制性内切酶的工具酶甲基化特异性的限制性内切酶(MDRE)：可以识别甲基化的胞嘧啶甲基化敏感性的限制性内切酶(MSRE)：可以识别甲基化的胞嘧啶目前二十五页\总数七十二页\编于十二点基于限制性内切酶的甲基化分析方法目前二十六页\总数七十二页\编于十二点MSRE-PCR原理图1-1MSRE-PCR原理图注：左图DNA无甲基化,DNA被切断,无法得到PCR产物;右图DNA有甲基化,DNA保持完整,可以获得PCR产物.目前二十七页\总数七十二页\编于十二点应用举例二：采用甲基化敏感性限制性内切酶技术结合PCR的方法（MSRE-PCR）筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化差异的基因。目前二十八页\总数七十二页\编于十二点图1-3：DNM基因琼脂糖凝胶电泳图M21AE17B17BE17A17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500bp注：M：Marker；E：加酶体系；A：癌组织；B：癌旁组织；空：水空白目前二十九页\总数七十二页\编于十二点酶识别位点内含有一个及以上CpG位点应用条件：目前三十页\总数七十二页\编于十二点结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法优点：①方法相对简单；②可进行甲基化水平的定量研究；③需要样本量少。目前三十一页\总数七十二页\编于十二点缺点：①由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序列的CG将被忽略；②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义；④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题；结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法目前三十二页\总数七十二页\编于十二点应用五：RestrictionDigestionandReal-TimePCR(qAMP)目前三十三页\总数七十二页\编于十二点基本步骤目前三十四页\总数七十二页\编于十二点举例：Theevalutionofdifferentiallymethylatedregion(MDR)ofimprintedgeneU2af1-rs1,intestisandliverofmousePrimeraredesigned

toflankNotl(N),Hhal(Hh),andMcrBc(M)RestrictionsitesintheDMRregion.目前三十五页\总数七十二页\编于十二点LiverandtestisgenomicDNAtemplatesarePCRamplicatedfollowingdigestionwithnoenzyme(sham),Notl,Hhal(Hh)orMcrBc.AmplicationusingasecondprimerpairthathasbeendesignedtoasequencedevoidOfrestrictionsitesdemonstratesthatthetemplatesareofequalconcentration.目前三十六页\总数七十二页\编于十二点ThedifferenceintheCt

valueofanenzyme-digestedtemplaterelativetothesham-digestedtemplatedeterminatesthelevelsofDNAmethylationineachtissue.MSREMDRE目前三十七页\总数七十二页\编于十二点

应用六：基于亲和纯化的甲基化分析方法

目前三十八页\总数七十二页\编于十二点

基于亲和纯化的甲基化分析方法

目前三十九页\总数七十二页\编于十二点目前四十页\总数七十二页\编于十二点应用七：ChIP-Seq技术

目前四十一页\总数七十二页\编于十二点ChIP-Seq

目前四十二页\总数七十二页\编于十二点应用八：芯片技术在甲基化检测中的应用目前四十三页\总数七十二页\编于十二点启动子区甲基化芯片技术目前四十四页\总数七十二页\编于十二点基因芯片杂交信号图目前四十五页\总数七十二页\编于十二点目前四十六页\总数七十二页\编于十二点目前四十七页\总数七十二页\编于十二点应用九、质谱技术（MassSpectromericAnalysisofCytosineMethylationbyBase-SpecificCleavageandPrimerExtensionMethods）目前四十八页\总数七十二页\编于十二点如图所示切下的每个片段含有一个或两个CpG位点，在质谱图上甲基化片段和未甲基化片段大小相差16Da或32DaBase-SpecificCleavage目前四十九页\总数七十二页\编于十二点PrimerExtensionMethods目前五十页\总数七十二页\编于十二点如图所示，用ddC和ddT终止延伸后，在质谱图上显示出甲基化组（ddC）和未甲基化组(ddT)的质谱峰,二者相差16Da。目前五十一页\总数七十二页\编于十二点Base-SpecificCleavage检测的是一个酶切后片段的甲基化状态，用于在长片段DNA序列（如基因启动子区域）中筛选甲基化位点并确定每个甲基化位点的甲基化程度，而在基因的甲基化谱确定后可以用PrimerExtensionMethods精确的对每个CpG位点的甲基化程度进行定量检测，PrimerExtensionMethods最多可以实现25个位点同时检测。目前五十二页\总数七十二页\编于十二点质谱法检测的优势：灵敏度准确性高。操作较简便。局限性：DNA样本要求纯度较高，提取过程中的小离子，未消化完全的蛋白，RNA对结果有干扰作用。需用质谱仪。目前五十三页\总数七十二页\编于十二点应用十、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法（methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension(Ms-SNuPE)）目前五十四页\总数七十二页\编于十二点扩增基因组DNA样本重亚硫酸盐转化ExoSAP消化PCR引物延伸加入SNP引物和SNaPshotMixSNP引物延伸(加入ddT或ddC)SAP处理分析310/3100样本准备加入GS120LIZ内标ABI310/3100电泳选用E5和POP4胶数据分析（GeneScan）样本分型（Genotyper或GeneMapperID）步骤目前五十五页\总数七十二页\编于十二点123456这是一个多重SNaPshot的检测结果，总共检测了6个CpG位点，阴影峰代表甲基化的C，空白峰代表未甲基化C。位点1、2和4显示大约50%的甲基化率，而位点3、5和6显示0的甲基化率。目前五十六页\总数七十二页\编于十二点应用十一：高分辨熔解曲线分析

MS-HRM

目前五十七页\总数七十二页\编于十二点HRM技术：用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点鉴定感兴趣的CpG岛。目前五十八页\总数七十二页\编于十二点HRM技术原理目前五十九页\总数七十二页\编于十二点HRM技术原理目前六十页\总数七十二页\编于十二点HRM特点高灵敏性：可检测低达0.1%甲基化程度。高通量：1次可同时检测不超过384样本，适用于大样本多位点甲基化扫描。高重复性：重复性100%。使用范围广：不受碱基位点局限。

操作简便：只需设计特异引物，无须序列特异性探针，无需测序。标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。缺点：检测序列长度不应超过100bp；

只能进行半定量检测目前六十一页\总数七十二页\编于十二点应用十二：焦磷酸测序法目前六十二页\总数七十二页\编于十二点焦磷酸测序法（Pyrosequencing）目前六十三页\总数七十二页\编于十二点焦磷酸测序法（Pyrosequencing）目前六十四页\总数七十二页\编于十二点焦磷酸测序目前六十五页\总数七十二页\编于十二点焦磷酸测序目前六十六页\总数七十二页\编于十二点焦磷酸测序目前六十七页\总数七十二页\编于十二点焦磷酸测序的优势：灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域。除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化。

对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点；对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本。目前六十八页\总数七十二页\编于十二点目前六十九页\总数七十二页\编于十二点应用十三：QuantificationofMethylatedDNAbyHeavyMethylDuplexPCR目前七十页\总数七十二页\编于十二点PrincipleofHeavyMethyl(A)WhentheDNAismethylated,theblockeroligonucleotides(solidblack)donotbind,leavingtheprimerbindingsiteaccessiblefortheprimers(grayarrows)tobindandamplifythetarget.Theamplicationisdetectedwithamethylationspecificoligonucleotideprobe[solidblack,labeledwithfuorescen