DNA重组技术的基本工具

基因工程专题1目前一页\总数三十四页\编于十二点烟草据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人中国卫生部通报：2004年７月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%

能产生狂犬病抗体蛋白的转基因目前二页\总数三十四页\编于十二点每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药——据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。为什么基因可以在其他种类的生物中表达？密码子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白质(性状)转录翻译通用目前三页\总数三十四页\编于十二点基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论达尔文提出生物进化论目前四页\总数三十四页\编于十二点基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律目前五页\总数三十四页\编于十二点基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论

摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。目前六页\总数三十四页\编于十二点基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。目前七页\总数三十四页\编于十二点基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。目前八页\总数三十四页\编于十二点基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制目前九页\总数三十四页\编于十二点基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制目前十页\总数三十四页\编于十二点基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。目前十一页\总数三十四页\编于十二点目前十二页\总数三十四页\编于十二点基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明目前十三页\总数三十四页\编于十二点什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。目前十四页\总数三十四页\编于十二点基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的新生物类型和产品剪切→拼接→导入→表达目前十五页\总数三十四页\编于十二点专题一基因工程“分子手术刀”──限制酶

“分子缝合针”──DNA连接酶

“分子运输车”

──基因进入受体细胞的载体

§1DNA重组技术的基本工具目前十六页\总数三十四页\编于十二点提示：原核生物在长期的进化过程中产生的保护机制，可防止外源DNA的入侵而灭绝。1.限制性内切酶从哪里寻找？Why？思考2.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？不具备这种限制酶的识别切割序列通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶目前十七页\总数三十四页\编于十二点限制性核酸内切酶的作用特点：从特定部位的两

个核苷酸之间切开。

（磷酸二酯键）能识别特定核苷

酸序列；T1234512345A目前十八页\总数三十四页\编于十二点

EcoRⅠ黏性末端黏性末端目前十九页\总数三十四页\编于十二点SmaⅠ平末端平末端目前二十页\总数三十四页\编于十二点限制酶所识别的序列的特点：

中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。P7思1EcoRⅠSmaⅠ目前二十一页\总数三十四页\编于十二点识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是原核生物4000种。1、来源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶黏性末端平末端目前二十二页\总数三十四页\编于十二点1、分类E.ColiDNA连接酶T4DNA连接酶2、作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。二、“分子缝合针”——DNA连接酶目前二十三页\总数三十四页\编于十二点可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键目前二十四页\总数三十四页\编于十二点

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶目前二十五页\总数三十四页\编于十二点AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGUUGUUADNA聚合酶DNA连接酶寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?目前二十六页\总数三十四页\编于十二点DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)能将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板查询：P7思4目前二十七页\总数三十四页\编于十二点三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达⑷有某些标记基因，便于筛选⒉常用运载体：⑴质粒⑵病毒包括植物病毒、动物病毒和细菌病毒（噬菌体）⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？

⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？

（最常用）目前二十八页\总数三十四页\编于十二点

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且有自我复制能力的双链环状DNA分子。目前二十九页\总数三十四页\编于十二点能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别P7思3实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。目前三十页\总数三十四页\编于十二点已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素试一试目前三十一页\总数三十四页\编于十二点对照组实验组1实验组2实验组3结论预期一＋＋＋＋预期二＋＋－－预期三＋－＋－预期四＋－－－对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因目前三十二页\总数三十四页\编于十二点模拟制作——课后完成用剪刀在特定部位对棉花DNA进行