上海市临检中心 PCR培训课件 20、赛沛马林-分子诊断POCT的进展与临床应用

分子诊断POC

进展及临床应用马林Cepheid1©Cepheid内容分子诊断领域的革新POCT分子诊断技术分子诊断POCT的临床应用2©Cepheid分子诊断领域的革新3©Cepheid近期分子诊断发生了哪些革新？更快的单个项目检测(15分钟)如

流感更多的检测菜单

(>20)可检测血液、呼吸道样本、胃肠样本和脑膜炎/脑炎4©Cepheid商业化分子诊断平台:

>20

项检测Biofire/bioMérieux

filmarrayCepheidGeneXpertBDMAXAlere

iRocheLightCyclerbioMérieux

NucliSensEasyQNanosphere

Verigene实例：阳性血培养物的多重检测菜单为什么应用分子诊断检测？•

传统的检测方法过于耗时‒

改善结核诊断（2小时

vs

3-4周）•

传统检测方法灵敏度欠佳‒

替代不准确的快速流感病毒检测•

没有合适的传统检测方法‒

诺如病毒的检测•

改善抗菌药物管理‒

快速获得检测结果可以指导抗菌、抗真菌、抗病毒药物的使用7©Cepheid何时需要改善诊断并保证经济效益？•

败血症患者需要快速确认正确的抗生素疗法•

疑似肺结核、流感患者•

急诊的脑膜炎儿童•

孕妇：B族链球菌定植•

性传播疾病就诊患者：淋球菌和沙眼衣原体8©Cepheid结果耗时、临床价值低

–

需要改变感染报告发给临床医生药敏试验

(难培养)药敏试验初始报告培养96(4天!!!)48小时7224采样9©Cepheid分子诊断带来革新采样/培养阳性物启动最佳的抗菌治疗方案PCR报告混合感染给到临床医生药敏试验

(难培养)药敏试验培养01-324小时PCR

检测分子诊断检测血培养示例：

S.aureus,

MRSA,

CoNS簇状排列的革兰氏阳性球菌PCR法检测

MRSA/SA

(GeneXpert

1小时)纳米探针的PCR/芯片法：

Nanosphere

(3

小时)Filmarray

(BioFire):

S.aureus,mecA耐药基因(1

小时)ALDI-TOFIDPNA

-FISH

~30分钟

MRSA

快速筛查11

©CepheidPOC

分子诊断技术12

©Cepheid传统分子检测流程样本采集和处理DNA/RNA提取纯化浓度纯度质控普通PCR电泳/测序/芯片PCR体系构建Real-time

PCR13

©Cepheid标准PC

实验室•

分区：3-4室•

单向气流•

目的：防止污染！新一代快速的POC

分子诊断平台GeneXpert®Omni15

©CepheidBioFire

FilmArray核酸提取和制备核酸扩增产物检测16

©CepheidBioFire

FilmArrayFilm=塑料膜Array=阵列17

©CepheidFilmArray

工作原理试剂储存区化学反应区核酸的提取与纯化第一阶段多重PCR反应第二阶段巢式PCR反应18

©CepheidFilmArray工作原理65分钟运行时间8.

FilmArray仪器测试每个小孔中产物的熔解曲线，以判断是否存在待测产物。19

©CepheidFilmArray

质控•

全程内参——DNA/RNA处理对照干粉状态的Schizosaccharomyces

pombe从第一步开始，同样本一同进行实验•

扩增内参——第二阶段PCR对照阵列内带有已知的DNA模板序列第二阶段PCR对照DNA/RNA处理对照20

©Cepheid结果分析•

所有靶标都重复测试3次•

三次测试中，2个以上阳性才会判读为阳性•

熔解曲线峰值必须处于正确温度区间•

重复测试的熔解曲线峰值必须高度一致•

两个内参必须都检出(全程内参和扩增内参)Bordetellapertussis21

©CepheidGENEXPER

系统‘分子诊断服务器’架构使得系统通量可以随测试量的增长而上升•

模块独立，随来随做GeneXper

模块柱塞杆马达主板I-CORE阀驱动马达试剂盒装载仓室超声变幅器23

©Cepheid试剂盒中的PC

实验室24

©CepheidGeneXper

试剂盒设计传统PCR检测需要3个独立分Xpert试剂盒自带11个独立腔道，在单一试剂盒中即可完成样本核酸提取、反应体系配置及PCR检测区房间25

©CepheidGeneXper

设计理念系统与试剂盒之间无“湿性”界面，整个过程封闭操作，杜绝污染系统中整合超声破碎，可快速裂解细胞每个试剂盒中都包含质控

—

无需额外的外部阳性或阴性质控智能流体学设计

软件操控马达，完成活塞杆提升下降、腔道开放关闭及液体流动

精准的微流体力学技术，可完成复杂的各种标本制备程序

(从数ml至10μl)自动分析数据并解读结果26

©CepheidGeneXper

检测原理及质控示例•

5条重叠探针–

只与野生型基因片段但不和突变的序列相结合•

1条探针检测样本处理质控-SPC(球芽孢杆菌)•

共有6种荧光染料同时检测27

©Cepheid内部质控

探针检查质控(PCC)•

探针检查质控(PCC)–

在热循环启动之前，测试不同温度下荧光信号读数值，从而评估试剂盒内试剂是否能正常反应.•

PCC可以验证:•

试剂珠再水化•

PCR反应管填充•

探针的完整性•

荧光染料或试剂/荧光淬灭剂的稳定性•

结果自动与软件中厂家预设的参数进行比较•

终止测试，如果探针检查未通过28

©Cepheid内部质控

样本处理质控(SPC)•

样本处理质控

(SPC)•

非感染性的芽胞•

验证菌体是否能够成功裂解•

检测体系中是否存在与标本有关的扩增抑制因子：如果样本检测结果为阴性，则SPC检测应为阳性；如果样本检测结果为阳性，则SPC检测可为阴性，也可为阳性.•

如果样本检测结果为阴性，而SPC检测也为阴性，则样本检测结果无效29

©CepheidXper

MTB/RIF结果判读法则30

©CepheidGeneXper

检测结果示例结果解释样本及测试信息实时

PCR扩增曲线PAGE

|

3131

©CepheidGeneXper

检测结果示例32

©Cepheid其他检测示例：CT/NG

及HI

病毒载量33

©CepheidXper

检测试剂盒的内部质控特性PCC探SAC样本充分性质控SPC样本检测结果（如果质控失败）检测步骤验证方面检查状态

针检查质控处理质控光学、机械、湿度、检测盒完整性XX错误错误仪器检查状态声波降解控制*样本中有足量的人类细胞*XX无效**无效**核酸提取X样本处理与PCR反应混

适当数量的试剂微珠X错误错误错误错误合物的制备探针完整性XPCR反应管完全填充PCR反应的适宜反应条件XXXXXX无过量PCR抑制剂无效**34

©CepheidRoche

cobas

Liat•

现有测试‒

cobas®

InfluenzaA/B‒

cobas®

StrepA‒

cobas®

InfluenzaA/B&RSV•

报告时间：15-20分钟35

©Cepheid–

Confidential.

For

internaluse

only.Alere

i•

现有测试‒

Alere

™

iInfluenzaA&Btest‒

Alere

™

iRSVtest‒

Alere

™

iStrepAtest•

报告时间：<15分钟36

©Cepheid–

Confidential.

For

internaluse

only.分子诊断POC

技术的临床应用37

©CepheidFilmArrayRP

Pane

上呼吸道感染测试病毒(17种):腺病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒冠状病毒HKU1冠状病毒NL63冠状病毒229E冠状病毒OC43人类偏肺病毒人鼻病毒/肠病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亚型甲型流感病毒H1-2009亚型甲型流感病毒H3亚型乙型流感病毒细菌(3种):百日咳杆菌肺炎衣原体肺炎支原体3838

©CepheidFilmArrayGI

Pane

胃肠道感染测试细菌(7种):寄生虫(4种):隐孢子虫弯曲菌(空肠、结肠、乌普萨拉)难辨梭菌(毒素A/B)类志贺邻单胞菌沙门菌环孢子虫痢疾阿米巴兰伯氏贾第鞭毛虫弧菌(副溶血、创伤、霍乱)霍乱弧菌病毒(5种):小肠结肠耶尔森菌腺病毒F组40/41星状病毒致泻大肠埃希菌/志贺菌(6种):肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)肠致病性大肠埃希菌(EPEC)产类志贺毒素大肠埃希菌(STEC)大肠埃希菌O157诺如病毒GI/GII轮状病毒

A群札如病毒(I,

II,IV和V型)志贺菌/肠侵入性大肠埃希菌(EIEC)39

©CepheidFilmArrayME

Pane

脑膜炎

脑炎测试病毒(7种):细菌(6种):巨细胞病毒(CMV)肠病毒单纯疱疹病毒1

型(HSV-1)单纯疱疹病毒

2型(HSV-2)人疱疹病毒6型(HHV-6)人双埃可病毒大肠埃希菌流感嗜血杆菌单核细胞增生李斯特菌脑膜炎奈瑟菌无乳链球菌肺炎链球菌水痘-带状疱疹病毒(VZV)真菌(1种):新型隐球菌C.

neoformans/C.

gattii40

©CepheidPCR检测培养/药敏(Hours

toappropriate

Rx)(Hours

onwrong

Rx)患者获得正确疗法的时间快了10倍/结束错误疗法的时间缩短4倍挽救生命，减少医疗支出41

©CepheidGeneXper

检测菜单当前检测开发中的检测MRSA(MRSA主动监测)TB

XDR

（结核多重耐药）SA

Nasal

Complete(SA/MRSA主动监测)MRSASSTI/BC皮肤和血培养MRSA诊断C.difficile(产毒艰难梭菌)胃肠道多重检测XpressPertussis（百日咳）XpressGBSUltra（超敏GBS）CMV

ViralLoad（巨细胞病毒载量）HBVViralLoad（HBV病毒载量）HCVFSVL（指尖血HCV病毒载量）Norovirus(诺如病毒)vanA/vanB(耐万古霉素肠球菌）Carba-R(耐碳青霉烯肠杆菌5种基因型检测)MTB/RIF

(结核分枝杆菌和利福平耐药)Enterovirus

(肠道病毒)XpressFlu/RSV(流感病毒A/B与呼吸道合胞病毒)Ebola(埃博拉病毒)胰腺癌早期检测乳腺癌监测前列腺癌早期检测EGFRMonitor

(肺)肺癌早期检测CT/NG(沙眼衣原体/淋球菌)Trichomonas

(阴道毛滴虫)GBS(B族链球菌筛查)HPVHIV-1Qualitative（HIV定性）HIV-1ViralLoad（HIV-1病毒载量）HCVViralLoad（超敏HCV病毒载量）BCR-ABL

Ultra(慢性粒细胞白血病融合基因)FII&FV42

©CepheidXper

MTB/RIF

结核分枝杆菌与耐药检测系统内自动完成痰标本与处理液1：2混合标本自动清洗过滤超声裂解DNA提纯DNA和PCR反应半巢式实时荧光定量核酸扩增检测试剂混合打印检测报告吸取2ml处理样品到反应盒将反应盒放入检测模块（手工操作完成）获得检测结果时间：1小时50分钟Source:Boehmeet

al.,NEJM201043

©Cepheid结核病的分散式检测移动TB检测站坦桑尼亚太阳能TB检测乌干达快速分子诊断方法检测Fl

及RS

的必要性•

快速酶联免疫测试的灵敏度仅在50%-70%之间

–

阴性结果需病毒培养确认•

呼吸道合胞病毒快速抗原检测试剂在成人诊断中的平均灵敏度为

29%•

流感和呼吸道合胞病毒的流行季经常重叠且临床症状相似–

因此很难在两种感染之间进行明确的区分•

流感有对应的抗病毒治疗策略但RSV没有*Harper

et

al.,Seasonal

Influenza

inAdultsand

Children—Diagnosis,Treatment,

Chemoprophylaxis,

and

InstitutionalOutbreak

Management:

Clinical

Practice

Guidelines

of

theInfectiousDiseasesSociety

of

America,

Clinical

InfectiousDiseases2009.

/rsv/about/faq.html**Banerjiet

al.Pediatr

InfectDisJ.2009

Aug;28(8):702-6.

doi:

10.1097/INF.0b013e31