上海市临检中心 PCR培训班 临床分子诊断质量管理及方法学验证要求

2013-3-15分子诊断面临的挑战临床分子诊断质量管理及方法学验证要求•••••更高的准确性要求缺乏标准化规范如何监管缺乏共识结果报告缺乏标准化……刘维薇Ph.D

助理研究员复旦大学附属华山医院检验医学科WhyCAPand

ISO15189?提

纲一、CAP认可对分子诊断的基本要求二、分析前质量控制(方法学验证)三、分析中质量控制••CAP

15189SM–

Accreditation

totheISO15189:2007StandardCAP

15189is

available

toU.S.-basedmedical.must

beCAP-accredited.四、分析后质量控制五、能力验证试验一、CAP认可对分子诊断的基本要求12013-3-15CONTENTS••••••SUMMARY

OFCHANGESUNDERSTANDINGTHE2010CAP

ACCREDITATION

CHECKLISTCOMPONENTSHOWTOINSPECTUSINGR.O.A.D

INSPECTIONTECHNIQUEADDITIONAL

INFORMATIONAPPLICABILITYPROFICIENCY

TESTINGPARENTAGE

AND

FORENSICIDENTITYTESTINGINSITUHYBRIDIZATION

(ISH)FluorescenceInSituHybridization(FISH)BrightfieldInSituHybridizationPERSONNELPHYSICAL

FACILITIESAND

EQUIPMENTINSTRUMENTSSPECIMEN

HANDLINGSignalDetectionInstrumentsFilmProcessing/Photographic

EquipmentElectrophoresisEquipmentandPower

SuppliesPipettesThermometersandTemperature-DependentEquipmentSpace•LABORATORY

SAFETYRADIATION

SAFETYCONTENTS•••••••SUMMARY

OFCHANGESUNDERSTANDINGTHE2010CAP

ACCREDITATION

CHECKLISTCOMPONENTSHOWTOINSPECTUSINGR.O.A.D

INSPECTIONTECHNIQUEADDITIONAL

INFORMATIONAPPLICABILITYPROFICIENCY

TESTINGQUALITY

MANAGEMENT

AND

QUALITY

CONTROLGENERAL

ISSUES二、分析前质量控制PROCEDUREMANUALASSAY

VALIDATIONREQUISITIONSSPECIMEN

HANDLINGSPECIMENPROCESSINGQUANTITATIVE

ASSAYS:

CALIBRATION

AND

STANDARDREAGENTSCONTROLSANALYSISExtractionAmplificationRestriction

EndonucleasesSequencingDetection

MethodsAgarose

andPolyacrylamideGelElectrophoresisReal-TimePolymeraseChainReaction(PCR)

ArraysCONTENTS•••••••SUMMARY

OFCHANGESUNDERSTANDINGTHE2010CAP

ACCREDITATION

CHECKLISTCOMPONENTSHOWTOINSPECTUSINGR.O.A.D

INSPECTIONTECHNIQUEADDITIONAL

INFORMATIONAPPLICABILITYPROFICIENCY

TESTINGQUALITY

MANAGEMENT

AND

QUALITY

CONTROLGENERAL

ISSUESPROCEDUREMANUALASSAY

VALIDATIONREQUISITIONSSPECIMEN

HANDLINGSPECIMENPROCESSINGQUANTITATIVE

ASSAYS:

CALIBRATION

AND

STANDARDREAGENTSCONTROLSANALYSISExtractionAmplificationRestriction

EndonucleasesSequencingDetection

MethodsAgarose

andPolyacrylamideGelElectrophoresisReal-TimePolymeraseChainReaction(PCR)

Arrays22013-3-15CONTENTS•••••••SUMMARY

OFCHANGESUNDERSTANDINGTHE2010CAP

ACCREDITATION

CHECKLISTCOMPONENTSHOWTOINSPECTUSINGR.O.A.D

INSPECTIONTECHNIQUEADDITIONAL

INFORMATIONAPPLICABILITYPROFICIENCY

TESTINGQUALITY

MANAGEMENT

AND

QUALITY

CONTROLGENERAL

ISSUESPROCEDUREMANUALASSAY

VALIDATIONREQUISITIONSSPECIMEN

HANDLINGSPECIMENPROCESSINGQUANTITATIVE

ASSAYS:

CALIBRATION

AND

STANDARDREAGENTSCONTROLSANALYSISExtractionAmplificationRestriction

EndonucleasesSequencingDetection

MethodsAgarose

andPolyacrylamideGelElectrophoresisReal-TimePolymeraseChainReaction(PCR)

Arrays验证试验••Itis

importantto

confirmtheanalyticalperformancecharacteristicsoftheassayandtoconfirmtheclinicalvalidityoftheassay.Performance

characteristicsthatshouldbedeterminedpriortoreportingpatienttestresultsincludediagnosticandanalyticalsensitivity,diagnosticandanalytical

specificity,

precision,linearity(forquantitativetests),thereportablerangeofpatienttestresults;the

referencerange(normalvalues);andanyotherapplicableperformance

characteristic.32013-3-152009,theCollegeof

American

Pathologists(CAP)

releasedits

firstdraftof‘‘A

Risk-BasedProposalforLDTOversight.’’IVDs.

And

LDTs.••In

vitrodiagnostics(IVDs):商业化生产；通过FDA510(k)clearance

orPMA(premarketapproval)。Laboratory-developed

tests(LDTs):许多新的分子诊断实验局限于实验室内使用（科研开展）。FDA

clearedorapprovedbecauselow

testvolumesmakeiteconomicallyunfeasibleto

gothroughthecurrentFDA510(k)orPMAapprovalprocess.•••FDA

cleared:In

vitrodiagnosticsthathavegonethroughandpasseda510(k)trial.FDA

approved:

AnIVDthathasgonethroughandpassedaPMA

trial.510(k)

trialsaredesignedto

showthatanIVDissubstantiallyequivalent

to

a

legallymarketedpredicatedevice.510(k)trialsarelessinvolved

andlessexpensive

thanPMA

trials.•Premarket

approvaltrialsarerequiredfor

classIII

medicaldevicesorifthereisnopredicatedeviceavailableforcomparison.

Theyaresignificantlymore

expensive

to

perform

than510(k)trials.Verification/确证试验Validation/验证试验•使用范围：LDTs,andmodifiedFDA-cleared/approvedtests主要目的：验证本试验在临床使用的各项性能指标及其实际效果主要指标：•••使用范围：FDA-cleared/approvedtests••主要目的：确证厂家提供的数据在本实验室的的实际效果主要指标：准确性、精确性、参考范围和可报告范围（这些指标通常在厂商的说明书中提及）。准确性、精确性、参考范围和可以接受范围（与确证实验要求相同）分析敏感性、分析特异性（验证试验要求）其他涉及的重要的评价指标（标本稳定性、干扰物质、线性……）（验证试验要求）PARR•与确诊试验相比相对复杂(precision,accuracy,

reportable

range,

and

reference

range).PARR+AS+AS(precision,accuracy,

reportablerange,

reference

range,analyticsensitivity,

andanalytic

specificity)其他涉及的重要的评价指标Clinicalvalidity/临床验证方法学验证的基本步骤••主要包括：临床敏感性和特异性•

第一步:

方法学验证设计阶段非必须，可以引用文献报道的临床敏感性和特异性最为支撑。••第二步

具体实施，搜集数据阶段:••临床敏感性：

针对某些非常见的疾病，由于病例的限制，实验室进行评价存有一定难度。第三步：补充阶段临床特异性：正常对照容易收集，故容易实现。42013-3-15--ForanFDA-approved

test：••相对简单阐明检测的应用范围以及预期观察的指标第一步:方法学验证设计阶段--ForanLDTormodifiedFDA-approved

test：••••相对复杂临床应用价值（临床采用该检测的价值和危险）临床指征（尽可能涵盖所有适合采用该检测的临床指征）仔细评价文献报道决定临床使用价值：特别是当实验室对该检测知之甚少或者在临床诊断实践中缺乏足够先例

。运筹于帷幄之中，决胜于千里之外！其他因素----分析前和分析后因素•••••••检测目的

(如筛选、诊断、预后、预测、监测、确诊……）----临床方面：标本类型

(全血、血清、血浆、尿液…..)标本采集和处理程序拒收原则••错误的结果对病人可能造成的危险快速TAT时间的要求（特别是该试验时间对病人的诊断治疗产生关键性作用时）••是否有确认试验……目标人群……-----实验室方面：••••••对现仪器和试剂的需求和损耗的评估总的试验和手工处理的时间的评估试剂储备的评估其他技术准入的评估质控品的评估----和临床医生的沟通（特别可能会采用该试验的临床医生）••••临床诊断的需求他们是否对此感兴趣，并愿意采用这些试验用于临床诊断试验结果的表示形式…………定量确证实验•准确性••••精确性

(EP15-A2)分析检测范围可报告范围第二步:具体实施，搜集数据阶段线性(EP6-A)-•……----LDTsormodifiedFDA-approved

tests••干扰物质

(EP7-A2)临床应用表现52013-3-15定量验证实验定性确证实验••一致性：与参考方法的阳性和阴性一致性••基本方法同定量确证实验重复性：同一些样本的反复检测（批内、批间、不同检测者之间）涵盖其他病人标本用以分析潜在的干扰物质•一系列的临床标本，尽可能覆盖可报告范围，和对比方法（如测序等）比对结果。，(符合EP5-A238和EP09-A237的最低要求)。••或者用另一个通过验证过程的实验室的标本进行对比结果。•尚未包括其他的参数，如临床敏感性和特异性,可通过文献报道和其他外延的方式（如chart

reviews

）。CLSI（EP12-A35)推荐至少在10-20天内检测

50个阳性标本和50个阴性标本。其中一些标本还用来计算重复性。定性验证实验‘‘确证/验证实验中，究竟多少的标本能满足实验的需求?’’•••基本方法同定性确证实验干扰物质评价临床表现评价：----诊断已知的情况下，检测的结果可以直接用于计算临床敏感性和特异性，以及其他一些参数

。----诊断未知的情况下，可通过文献报道和其他外延的方式（如chartreviews

）实现。Itdepends

！运用不同荧光定量PCR系统检测HBV-DNA定量检测的偏差评估•••采用复旦附属华山医院门诊及住院慢性乙型肝炎患者血清40份。比对方法参考CLSI的EP9-A2文件。由于本实验室长期以来使用ABIPRISM

7000作为HBV-DNA核酸定量检测的主要仪器，仪器的稳定性以及准确度都有一定的保证：历年参加卫生部室间质评以及美国病理学家协会（CollegeofAmericanPathologists,CAP）室间质评（ProficiencyTesting,PT）成绩优秀，故本次将ABIPRISM

7000（以下简称ABI7000）作为对比方法（X变量），以RocheLightCycler480II（以下简称Roche480II）作为测试方法（Y变量），对两者的数据进行比对分析。62013-3-15结果：••初步数据检查：数据作图：下图1

A:Roche

480II双份测定的均值对ABI

7000双份测定均值的散点图

B:

Roche480II均值与ABI

7000均值差对（Roche

480II均值+ABI

7000均值）/2的偏差图••••X变量取值范围的检查：r=0.98≥0.975。线性回归分析：计算预期的偏差和它的可信区间：（0.25，0.36）内部性能标准比较以及实验修正：

对于HBV-DNA的检测，医学决定水平为104。经过计算，本次数据提示可接受偏差的上限大于预期偏差范围的上限，因此就目前而言，两仪器间无明显差异，无需修正。数据见下表。第三步:补充阶段结论：••我们认为目前两仪器的性能等同，相互之间的结果可以接受。不过值得注意的是，预期偏差的范围明显靠近于可接受偏差的一侧。因此需要定期（如仪器年检后）使用患者标本进行系统的偏差估计分析。这能够及时发现室间、室内质评无法显示的问题。做到及时发现，及时处理，及时纠正HBV-DNA定量水平（对数）医学决定水平4可接受医学决定水平的偏差范围3.6~4.44.25~4.36无需修正预期偏差的95%可信区间结论补充内容

Checklist方法学验证应用范围•验证总结完成交主任审核同意••••新项目临床开展之前••••••••••••••生物安全内容的更新标准操作规程的撰写和审核必要的worksheets的撰写和审核培训计划更新新项目科研开展之前新仪器使用之前更换试剂之前员工操作培训仪器维护的日程更新（如有必要）新仪器的性能验证（如有必要）信息系统的项目更新标本接收流程的更新标本拒收标准的更新临床医生的告知•……能力验证实验的计划……新方法的建立新仪器使用之前72013-3-15三、分析中质量控制CONTENTS•••••••SUMMARY

OFCHANGESUNDERSTANDINGTHE2010CAP

ACCREDITATION

CHECKLISTCOMPONENTSHOWTOINSPECTUSINGR.O.A.D

INSPECTIONTECHNIQUEADDITIONAL

INFORMATIONAPPLICABILITYPROFICIENCY

TESTINGQUALITY

MANAGEMENT

AND

QUALITY

CONTROLGENERAL

ISSUESPROCEDUREMANUALASSAY

VALIDATIONREQUISITIONSSPECIMEN

HANDLINGSPECIMENPROCESSINGQUANTITATIVE

ASSAYS:

CALIBRATION

AND

STANDARDREAGENTSCONTROLSANALYSISExtractionAmplificationRestriction

EndonucleasesSequencingDetection

MethodsAgarose

andPolyacrylamideGelElectrophoresisReal-TimePolymeraseChainReaction(PCR)

Arrays价82013-3-15定性试验的cut-off

值验证•

对采用cut-off值区分阴阳性的试验，每六个月需进行验证四、分析后质量控制•

换不同批号的试剂（除非证明试剂不影响•

QC

没有达到要求•

机器维护或者修理之后分子诊断报告•••方法介绍结果POSTANALYSISResults

ReportingRecords解释PARENTAGE

AND

FORENSICIDENTITYTESTINGINSITUHYBRIDIZATION

(ISH)FluorescenceInSituHybridization(FISH)BrightfieldInSituHybridizationPERSONNELPHYSICAL

FACILITIESAND

EQUIPMENTINSTRUMENTSSignalDetectionInstrumentsFilmProcessing/Photographic

EquipmentElectrophoresisEquipmentandPower

SuppliesPipettesThermometersandTemperature-DependentEquipmentSpace•LABORATORY

SAFETYRADIATION

SAFETYInterpretation•病例：病人乙肝行拉米夫定治疗后，出现变异，一段时间治疗后转为野生，但和临床表现并不同步。刘**11.2.16

11.5.20

11.8.26

11.8.31

11.11.29

11.11.3012.02.24低于检测下限HBV-DNAYMDD2.66e34.51e31.37e3变异变异野生•分析：调取原始结果，并标本复查,确认实验结果。扩增、克隆、测序后发现，存在野生型和突变型的混合。••结论：注意随访。方法学验证，半年一次比对。92013-3-15数据记录、保存和评估•

每日工作流程的记录。（日工作表）••2011年的QI目标：降低CMV的TAT时间。•

定期记录分子试验的统计学资料，如阳性率、突变率等。•

定期显示试验的TAT。每年的QI。2011年度与2010年度CMV-DNA报告时间十月份同期相比平均缩短0.01个工作日；十一月份同期相比平均缩短0.07个工作日；十二月份同期相比平均缩短0.71个工作日。总的TAT时间缩短了0.79个工作日。•

即使某项试验中止了，实验室也要保存有关该试验数据的书面和电子资料，并标上使用的起始日期和中止日期。-年相比翻了1倍有余，在标本量激增的同时报告时间并未延长反而缩短了。其中凝聚着分子组所有工作人员的汗水。•在节假日前增加检测频次，节前报告节前发，保证了这些病人节后看病是就能拿到报告单，以免延误诊断和治疗。Proficiency

Testing（PT）重在分析••所有对病人实施的项目都必须参加PT(至少半年一次）(CAPSurveys

oraccepted

byCAP)五、能力验证试验针对CAP没有PT的某一项目1.参加其他来源的PT

(至少半年一次）2.采用其他方法进行测定(至少半年一次）3.送其他实验室进行比对

(至少半年一次）ProficiencyTestingMonitoringbyAccreditation

Program102013-3-15COBAS®TaqMan®

HBV

Test检测系统与国产试剂HBV-DNA检测系统结果对比分析•主要评价两种方法的对比（相关性和一致性），未涉及每种方法各自的性能（如批内、批间重复性，线性，检测下限等指标）。•对比方法：采用RocheCOBASTaqman48HBVDNA定量试剂(COBAS

TaqMan

HBVTest，Roche)，在罗氏COBAS®AmpliPrep®提取仪上完成全自动提取和加样，扩增反应在Ro