基因实验诊断培训班 基因诊断在肿瘤疾病诊治的临床应用及价值

基因诊断在肿瘤疾病诊治的临床应用及价值天津市人民医院检验学部刘

蕊P

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÿw餀w.

f

i

nepr

i

nt

.内

容

简

介12…NC

CN指南与基因诊断…基因诊断的临床实验室技术…基因诊断在肿瘤疾病诊治的临床应用及价值…分子生物学实验室认可体会34TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÿww.

f

i

nepr

i

nt

.……NCC

N指南与基因诊断1•

NCCN

(

Na

t

i

ona

l

Compr

ehens

i

ve

Cancer

Net

wor

k)

：是由美国20个具有国际顶尖水平的癌症中心组成的主要面向癌症临床诊治的协作组织。NCCN自1995年起每年发表各类肿瘤的临床诊疗指南。NCC

N的肿瘤临床诊疗指南根据最新的临床研究结果在不断的快速更新中。•

NC

C

N，每年包括非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、浸润性乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌等10种肿瘤临床诊断及治疗最新指导性建议。•

具有权威性，绝大多数国家均依据此指南进行肿瘤临床诊治。•

NCCN的肿瘤临床实践指南中，有关基因突变检测已是某些药物选用的必检指标。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

www.

f

i

nepr

i

nt

.•

肿瘤学临床实践指南（中国版）•

NC

C

N中国版活动召集人：孙燕

教授

中国工程院院士中国医学科学院协和医科大学肿瘤医院；中国100余位肿瘤顶尖专家参与修订。NCCN中国版指南修订活动已经进入第5个年头，其规模和成效逐年扩大，到目前为止，中国版指南已覆盖10种常见肿瘤。NCCN中国版指南凝聚了中国专家组大量的智慧和心血，受到美国同行的尊重和重视，同时中国专家组的很多观点也被原版指南接受。•

同时也给我们临床实验室提出了新的课题。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

w3wÌw.

f

i

nepr

i

nt

.2…基因诊断的临床实验室技术一、基因诊断的基本概念基因诊断指在基因（DNA或R

NA)

水平，用聚合酶链反应（P

CR）、核酸分子杂交、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，从而对人体状态和疾病作出诊断,称为基因诊断。基因诊断的基础———遗传物质改变：•

DNA或R

NA水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高等；•

基因结构变化即突变，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活等。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÿww.

f

i

nepr

i

nt

.二

、

基因诊断常用技术与方法•

Sout

her

n印迹杂交•

Nor

t

her

n印迹杂交•

等位基因特异寡核苷酸探针杂交•

酶切谱分析•

DNA限制性片段长度多态性分析•

P

CR及其衍生技术•

基因测序•

DNA芯片技术TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÿww.

f

i

nepr

i

nt

.SouthernBlottingEthanolSpinProtKPhenolChloroSDStissuePaperTowelsP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

www.

f

i

nepr

i

nt

.TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÿwÌw.

f

i

nepr

i

nt

.RFLP--Restriction

FragmentLengthPolyhmorphism（限制性片段长度多态性分析，已知点突变的检测）PCR-RFLP法P

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

www.

f

i

nepr

i

nt

.PCR

ASOH探针法（等位基因特异寡核苷酸探针杂交）(Allelespecificoligonucleotidehybridizatlon,)检测基因点突变:

主是利用P

CR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交。AC病人正常TAS

O探针GP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wf

ww.

f

i

nepr

i

nt

.P

CR单链构象多态性（未知点突变检测）（P

CR-

si

ngl

e

st

r

and

c

onf

or

mat

i

on

pol

ymor

phi

sm,

P

CR-

SSCP）TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÌww.

f

i

nepr

i

nt

.PCR-SSCP

技术单链构象多态性是简捷、有效的基因突变分析方法。基本原理：单链

DNA

在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动率取决于链的长度及其空间构象。单链DNA

构象与其一级序列(

少至一个碱基的改变)

密切相关。DNA

序列变异可导致单链构象改变，会引起泳动泳变位，以此可将变异的DNA

与正常DNA区分开来。•

P

CR-

SSCP

技术策略：首先利用P

CR

技术扩增特定靶序列，将扩增产物变性处理，单链片段经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，比较待测片段与正常参照等长片段的电泳迁移率，实施基因突变分析。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÌww.

f

i

nepr

i

nt

.…基因诊断在肿瘤疾病诊治的临床应用及价值3TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÿww.

f

i

nepr

i

nt

.TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÿwÌw.

f

i

nepr

i

nt

.TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÿwÌw.

f

i

nepr

i

nt

.K-

r

as基因突变:一、

K-

r

as基因基本知识•

K-

r

as基因位于12号染色体短臂上,长度约45

000个碱基对。•

r

as基因的编码产物为相对分子质量2.1万的蛋白质，故称为P21蛋白。由188～189

个氨基酸构成，与细胞的生长、分化密切相关。•

r

as(

P21)

蛋白位于细胞膜内侧，它在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。它属于三磷酸鸟苷(

GTP

)

结合蛋白(

一种细胞信息传递的耦联因子)

，通过GTP与二磷酸鸟苷(

GDP

)

的相互转化来调节信息的传递。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÌww.

f

i

nepr

i

nt

.•

肿瘤K-

r

as基因突变方式是单一碱基置换导致组成蛋白的单一氨基酸的改变。•

突变的结果导致基因编码产物持续偶联于GTP使之处于活化状态而导致细胞过度增生。98%突变属第二外显子第12密码子突变。•

K-

r

as基因第二外显子12密码子的野生型是GGT，突变型常见为GAT、GTT、CGT，此三种类型占所有突变类型的60%~100%。•

K-

r

as基因点突变：多发生在第12、13和61密码子。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÌww.

f

i

nepr

i

nt

.二、K-

r

as基因突变的检测•

标本类型：胰腺组织、胰液、十二指肠液、外周血和粪便等。•

检测方法：•

（1）PCR

AS

OH(

Al

l

el

e

s

peci

f

i

c

ol

i

gonuc

l

eot

i

de

hybr

i

di

zat

l

on,

特异等位基因寡聚核苷酸探针杂交)•

（2）PCR

SSCP(

Si

ngl

e

st

r

and

c

onf

or

mat

i

on

pol

ymor

phi

sm,

单链构象多态性)•

（3）PCR

RFLP(Rest

r

i

ct

i

on

f

r

agment

l

engt

h

pol

ymor

phi

sm,

限制性片段长度多态性)•

（4）PCR

DS

M(

Di

r

ect

s

equenci

ng

met

hod,DNA序列直接测定)•

（5）PCR

SSP(

Se

que

nc

e

s

peci

al

pr

i

mer

s,

顺序特异性引物)TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

w3wÌw.

f

i

nepr

i

nt

.P

CR

SSP具有四大优点•

特异、敏感:

在P

CR最优化条件下,每对引物仅对有相应突变方式的模板进行扩增,提高退火温度又加强了这种特异性。•

无需酶切、杂交、放射性及非放射性显影技术。•

简捷快速而准确地结果判断：P

CR扩增后的处理过程十分简捷,仅根据是否存在特异产物的阳性条带而定,从样品处理到结果报告只需数小时。•

临床易普及应用。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÌww.

f

i

nepr

i

nt

.•

原理：根据决定某等位基因的碱基性质，设计3´端第一个碱基分别与各等位基因的特异性碱基相匹配的序列特异性引物，•

在P

CR

反应过程中，只有引物3´端第一个碱基与决定特定等位基因的碱基互补时才能实现DNA

片段的完全复制，根据P

CR

产物的有无进行等位基因的分型。•

根据K-

r

as基因第12密码子点突变方式(

CGT、GTT及GAT)

设计引物，有意义引物的3′末端碱基分别对应野生型GGT中第一个G突变为C,

第二个G突变为T及A,

通过P

CR扩增,产物借助常规电泳、染色即可知有无K-

r

as基因突变及突变方式。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

w¿ww.

f

i

nepr

i

nt

.引物•

Ｒ１＝５‘ＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡ３’Ｒ２＝５‘ＧＧＴＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＣ３’Ｒ３＝５‘ＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴ３’•

Ｒ４＝５‘ＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴG3’配对方式：•

Ｒ１～Ｒ４扩增出ＧＡＴ型突变，

88bp。

GGT•

Ｒ３～Ｒ４扩增出ＧＴＴ型突变，88bp。•

Ｒ２～Ｒ４扩增出ＣＧＴ型突变，89bp。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

www.

f

i

nepr

i

nt

.DNA模板的提取操作步骤P

CR扩增非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳EB染色、蒸馏水脱色紫外灯观察结果TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

www.

f

i

nepr

i

nt

.将含有K-

r

as基因突变的胰腺癌细胞株P

CNA-

1作为阳性对照，P

CR-

SSP检测结果：出现88bp或者89bp的电泳带，说明K-

r

as基因出现点突变，记为阳性。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÌww.

f

i

nepr

i

nt

.不同胰腺病变K-

r

as基因突变方式K-

r

as基因突变方式GAT

GTT病理类型（例）CGT胰腺癌（3）1013慢性胰腺炎（21）1050对照组（56）080例十二指肠液标本中K-

r

as，确诊的胰腺癌十二指肠液标本中K-

r

as基因突变率为66.

7%（2/

3），慢性胰腺炎的K-

r

as基因突变率为42.9%（9/

21）。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÌww.

f

i

nepr

i

nt

.…分子生物学实验室认可体会4•

人员•

检验程序•

设施和环境条件•

实验室设备•

检验前过程•

检验程序的质量保证•

检验后程序•

结果报告TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÿww.

f

i

nepr

i

nt

.环境设施•

实验室分区、流向合理，绝对不允许回流。•

试剂，质控物、校准品分区放置。•

实验室、生物安全柜消毒（台面、医疗废弃物、溢出物），防止污染以及一旦发生污染后的处理措施。•

实验室相关记录详实，如消毒记录、温湿度记录等。TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÌww.

f

i

nepr

i

nt

.仪器设备•

仪器性能验证：•

不确定度（批内、批间不精密度）•

线性范围测定•

最低检测下限测定•

使用、维护及校准TIANJINUNIONMEDICINECENTREP

DF

文件使用

"

pdf

Fact

or

y

Pr

o"

试用版本创建

wÌww.

f

i

nepr

i

nt

.检验程序•

检验目的？•

检验程序的原理？（实验基本原理，试剂中各种主要成分的作用（UNG酶、Tap酶等）•

性能参数（如线性、精密度、以测量不确定度表示的准确性、检出限、测量区间、测量真实性、灵敏度和特异性）？•

原始样品系统（如血浆、血清和尿液）？•

容器和添加物类型？•

要求的设备和试剂？•

校准程序（计量学溯源性）