细胞培养入门技术

细胞培养入门技术第一页，共46页。目的：了解哺乳动物细胞培养的一般步骤，学习细胞培养基本技术原理：无菌操作细胞休眠第二页，共46页。离心机橱柜实验台冰箱培养箱试剂柜实验仪器台超净工作台实验台实验台实验台实验台水池冰箱衣柜实验台显微镜递物窗缓冲间无菌操作室准备室1.细胞培养室设置细胞培养前的实验准备第三页，共46页。下风口上风口无菌操作室第四页，共46页。超净工作台和CO2培养箱2.细胞培养的主要实验设备超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2

使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒③箱内蒸馏水槽中预留灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。第五页，共46页。解剖显微镜倒置显微镜2.细胞培养的主要实验设备第六页，共46页。血清（天然成分）：基础培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM、α-MEM、RPMI1640水：高纯度的去离子水细胞培养的主要试剂（培养基）抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/ml

血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌血清的使用浓度为5％～20％消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁，用含血清培养液中止其活性第七页，共46页。细胞培养用器皿的清洗和消毒一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤：1、自来水浸泡2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理）3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水）4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用

常用消毒方法：1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），15磅，15～20min2、过滤除菌(如：血清的除菌）第八页，共46页。

细胞培养(cellculture)是指细胞的离体培养，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从机体中分离出来，置于培养皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和繁殖的方法。细胞培养（CellCulture）细胞培养的基本概念第九页，共46页。

原代培养(primaryculture)，或称为初代培养，就是从供体取下组织细胞后在体外进行的首次培养，中途不分割培养物。常用的原代培养方法有组织块培养法和消化培养法。原代培养（PrimaryCulture）细胞培养的基本概念第十页，共46页。传代培养（SecondlyCulture）

传代培养(secondlyculture)，在原代培养物铺展为单细胞层后，将原代培养细胞分开接种到两个或多个新的培养瓶中继续培养增殖。细胞培养的基本概念第十一页，共46页。细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫第十二页，共46页。培养细胞的类型

贴附型成纤维样细胞型上皮样细胞型悬浮型细胞培养的基本概念培养人真皮成纤维细胞培养人口腔上皮细胞培养的骨髓瘤细胞第十三页，共46页。贴附型细胞的生长特性

细胞的贴壁生长

接触抑制

细胞的生长曲线细胞贴壁延展过程(模式图)细胞培养的基本概念细胞的接触抑制现象第十四页，共46页。正常培养细胞的生长曲线退化死亡平台期细胞数增大极限点，出现接触抑制细胞指数生长极限点指数生长期潜伏期细胞数量024487296120小时指数生长期是最佳实验期!第十五页，共46页。培养细胞生长的条件1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-

渗透压

3无污染

4无毒第十六页，共46页。

细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml第十七页，共46页。消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用第十八页，共46页。培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染第十九页，共46页。合成培养基

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。第二十页，共46页。

人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

第二十一页，共46页。血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；

④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分第二十二页，共46页。一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．第二十三页，共46页。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌第二十四页，共46页。抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定第二十五页，共46页。完全培养基的组成基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100卑位／毫升第二十六页，共46页。培养基的配制

RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g

青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。

调节pH值至7.2

加血清（终浓度10％）

第二十七页，共46页。细胞的传代培养将原代培养物分割后重新接种到两个或多个培养瓶内进行培养，这一操作称为传代培养,传代比例为1:3至1:6，依细胞种类而异.细胞传代培养的意义传代时机的把握传代培养的代数限制；少数细胞可出现永生化第二十八页，共46页。吸去旧液加入消化液解离细胞约2min在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状细胞的传代培养：贴附型PBS洗涤1~2次吹打悬浮细胞调整细胞密度

分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察第二十九页，共46页。细胞的传代培养：贴附型培养细胞的观察培养液颜色、是否清亮培养细胞的状态第三十页，共46页。细胞的传代培养：贴附型吸去旧液加入消化液解离细胞约5min在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状PBS洗涤1~2次吹打悬浮细胞调整细胞密度

分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察胰酶消化数分钟细胞脱离器壁，呈圆粒状第三十一页，共46页。吸去旧液加入消化液解离细胞约2min在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状细胞的传代培养：贴附型PBS洗涤1~2次吹打悬浮细胞调整细胞密度

分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察中止消化、吹散细胞细胞计数，调节密度第三十二页，共46页。细胞的传代培养：悬浮型直立瓶去旧液加新液分瓶接种加新液第三十三页，共46页。无菌操作注意事项无菌操作中的注意事项

在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。第三十四页，共46页。细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。第三十五页，共46页。

冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。第三十六页，共46页。慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min

当温度达-25℃以下时，5～10℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存盒第三十七页，共46页。低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。第三十八页，共46页。细胞冻存方法1预先配制冻存液，避免因临时配制产热而伤害细胞配方：含血清培的完全培养基

5%DMSO2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)3加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4年后，存洁率可达80％以上。第三十九页，共46页。细胞复苏方法

（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。第四十页，共46页。细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数第四十一页，共46页。培养细胞活力测定

细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。

任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。1细胞克隆形成率实验

单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒