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第5章消毒灭菌与生物安全第一节消毒和灭菌《医院消毒技术规范》根据《中华人民共和国传染病防治法》、《中华人民共和国传染病防治法实施办法》和《消毒管理办法》制订本规范。目的:统一我国医院消毒、灭菌的方法和消毒、灭菌的监测技术,以提高医院消毒、灭菌的质量,减少医院感染。(JosephLister,1827~1912)首创用石炭酸喷洒手术室和煮沸手术用具以防术后感染,为防腐、消毒,以及无菌操作奠定了基础。约瑟夫.李斯特简介发明和推广外科防腐技术1827年生于英国尤普顿。伦敦大学学院的优等生,于1852年在该院获得医学学士。1861年他成为格拉斯哥皇家医院的外科医生,在这个时期他发明了外科防腐技术。在格拉斯哥皇家医院,李斯特主持新外区病房工作。他深为这里出现的术后高死亡率而感到惊恐不安。严重的感染如坏疽等是一种常见的术后并发症。李斯特尽力使病房保持十分清洁,但是这并不能避免高死亡率的发生。在1865年,李斯特读到了路易·巴斯德的一篇论文,豁然开朗,认识了疾病细菌学说。这给李斯特提供了关键的思想。如果感染是由细菌造成的,那么防止术后感染的最好办法是在细菌进入暴露的伤口之前就将其消灭。李斯特用石炭酸做灭菌剂,建立了一套新的灭菌法。他不仅在每项手术前认真洗手,而且还确保要使用的器皿和敷料都做彻底的卫生处理。实际上他在一个时期里甚至向手术室空中喷洒石炭酸,结果术后死亡率有了戏剧性的下降。从1861年到1865年期间,男性急诊病房中的术后死亡率为45
%,到1889年减少到
15
%。
约瑟夫·李斯特简介李斯特第一篇杰出的灭菌学论文发表于1867年。他的观点并未即刻被人们所接受。1869年他被任命为爱丁堡大学临床外科学教授。在任职七年期间,他名扬四海。1877年李斯特被任命为伦敦皇家学院临床外科教授,一任就是十五年之久。他在伦敦做的灭菌外科演示实验,引起了医学界的浓厚兴趣,接受他的思想的人在不断增多。李斯特的发现使外科学领域发生了彻底的革命,拯救了千百万人的生命。今天不仅死于术后感染的患者极为少见,而且也救活了许多这样的人:如果感染的危险还象前一个世纪一样大的话,他们是不会愿意接受手术治疗的。例如,一个世纪前,开胸手术一般不予以考虑。虽然现今的无菌外科技术和李斯特的灭菌方法有所不同,但是所涉及的思想基本相同,是李斯特原理的扩展。消毒灭菌常用术语1.灭菌(sterilization):杀灭物体上所有微生物的方法。包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。
2.消毒(disinfection):杀死物体上或环境中的病原微生物的方法。消毒灭菌常用术语3.防腐(antisepsis):抑制体外细菌和真菌生长繁殖的方法。4.无菌(asepsis)和无菌操作:无菌是无活菌的意思,多是灭菌的结果。防止细菌进入人体或其它物品的操作技术,称为无菌操作。二、物理消毒灭菌法
(一)热力消毒灭菌法
1.干热灭菌法(1)焚烧;
(2)烧灼;
(3)干烤;
(4)红外线(5)微波(microwave)
越南严防禽流感(1)焚烧禽流感Avianflu
自疯牛病大规模暴发以来,英国牛肉被禁止出口造成20亿英镑的巨大损失;为了防止疯牛病的蔓延,470万头30个月以上的牛被宰杀和销毁,英国政府为此赔偿了1.4亿英镑。英国处理疯牛(2)烧灼灭菌:直接用火焰灭菌,适用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌。电烤箱(3)干烤灭菌:用干烤箱,160-170℃,2h。用于玻璃器皿、瓷器或注射器等。(4)红外线消毒红外线是一种0.77~1000μm波长的电磁波,尤以1~10μm波长的热效应最强。但热效应只能在照射到的表面产生,因此不能使物体均匀加热。红外线的杀菌作用与干热相似,利用红外线烤箱灭菌所需的温度和时间亦同于干烤。此法多用于碗筷等餐具的表明消毒。(5)微波消毒微波是一种波长为1~1000mm左右的电磁波,其热效应原理是微波通过介质时,使极性分子快速运动,摩擦生热,里外温度同时上升。微波不能穿透金属表面,用于非金属的器械及食具的消毒。可穿透玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质。微波消毒必须在有一定含水量的条件下进行,在干燥条件下不能达到有效灭菌。2.湿热灭菌法(1)巴氏消毒法
61.1~62.8oC,30min;71.7oC,15~30s,用于牛乳制品、酒类等的消毒。市场上出售的袋装牛奶。LouisPasteur第2种方法可杀死牛奶中各种繁殖体致病菌,灭菌效率可达97.3%~99.9%,经消毒后残留的细菌多数是乳酸菌,对人有益无害。其杀菌时间更短,工作效率更高。巴氏消毒法来源于巴斯德解决啤酒变酸问题。当时法国酿酒业面临着一个令人头疼的问题,那就是啤酒在酿出后会变酸,根本无法饮用。巴斯德受人邀请去研究,经过长时间的观察,发现使啤酒变酸的罪魁祸首是乳酸杆菌。营养丰富的啤酒简直就是乳酸杆菌生长的天堂。采取简单的煮沸的方法是可以杀死乳酸杆菌的,但是,这样一来啤酒也就被煮坏了。巴斯德尝试使用不同的温度来杀死乳酸杆菌,而又不会破坏啤酒本身。最后研究结果:以50~60℃的温度加热啤酒半小时,就可以杀死啤酒里的乳酸杆菌,而不必煮沸。这方法挽救了法国的酿酒业。巴氏消毒法挽救了法国的酿酒业巴氏消毒法巴氏消毒最先用于牛奶的杀菌,其目的是杀死牛奶中可能存在的所有有害微生物(如布氏杆菌、结核杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等,但芽孢不能被彻底杀死)。在巴氏消毒法发明前,欧洲因喝生牛奶或吃乳制品而染结核病的人不计其数。由于当时还未发明抗菌素,因此,因结核病而死的人也是不计其数。自从巴氏消毒法广泛应用以后,因喝牛奶而染此病的人已很少见。但现在世界上也有一些地方的人喜欢喝生牛奶,比如我国的内蒙。据科学家调查,在内蒙牧民肺结核病人中,有10.6%的患者有喝生牛奶的习惯。UHT超高温瞬时灭菌法:140℃,2~3S.对牛乳或其他液态食品(如果汁及果汁饮料、豆乳、茶、酒及矿泉水等)最大优点是既能杀死产品中的微生物,又能较好地保持食品品质与营养价值。纸盒包装的牛奶大多是采用这种方法。“巴氏鲜奶是金,酸牛奶是银,奶粉是铜,常温奶(UHT)是铁”
巴氏消毒:63℃,30分钟;高温快速(HTST)的巴氏消毒:72℃,15秒;超高温(UHT)灭菌:135℃,一两秒
“生奶新标”2010年新出台的乳品安全国家标准新标准把每百克生乳的蛋白质最低含量从2.95克降低到2.80克生鲜乳细菌总数的最高限从每毫升50万个提高到200万个。
(2)煮沸法:100℃5min杀灭繁殖体,1~2h杀灭芽胞,加入2%的碳酸氢钠,促进芽胞的杀灭,防止金属器皿生锈,一般用于食具、刀剪、注射器的消毒。
(3)流动蒸汽消毒法;常压蒸汽消毒法,100℃15~30min杀灭繁殖体,但芽胞不被全部杀灭。
(4)间歇蒸汽灭菌法;100℃加热15~30min,37℃过夜,连续三次,用于含糖、牛奶等培养基。湿热灭菌法(5)高压蒸气灭菌法(最常用,效果最好)温度:121.3℃,时间:15~20min
压力:103.4Kpa(1.05Kg/cm2)
常用于耐高温、耐湿物品的灭菌,如培养基、生理盐水、手术敷料、手术器械、注射器、手术衣等。蒸汽压力与蒸汽温度的关系蒸汽压力空气全排全未排Mpakg/cm2Ib/in2时温度时温度0.060.598
112.6
0.070.7010
115.6
90
0.11.0515
121.3
100
手提高压蒸汽灭菌器(电热)微电脑立式高压灭菌器目前应用最广,灭菌效果最好的方法。适于耐高温和不怕潮湿的物品。如注射器、敷料、导管、手术衣、手术器械、培养基等的灭菌。
菌体蛋白质的凝固温度
与其含水量的关系
蛋白质含水量30min内凝固所需温度
(%)(℃)
50562574~801880~906145
0
160~170
干热灭菌与湿热灭菌穿透力及灭菌效果比较湿热灭菌比干热效果好1.湿热灭菌时,菌体蛋白质较易凝固。湿热灭菌时,菌体吸收水分,蛋白质含水愈多,凝固所需温度降低。2.湿热穿透力比干热大,可使被灭菌物品内部温度迅速上升。3.湿热蒸气可放出潜热,这种潜热迅速提高被灭菌物体的温度。(二)辐射杀菌法
1.紫外线
2.电离辐射
1.紫外线杀菌波长200~300nm的UV有杀菌作用,其中以265~266nm最强。杀菌机制:作用于DNA,形成胸腺嘧啶双聚体,干扰DNA的复制与转录。杀菌作用特点:穿透力弱,用于空气消毒和物体表面消毒。适用范围:手术室、传染病房、细菌实验室的空气消毒,或不耐热物品的表面消毒。杀菌机理:应用范围:2.电离辐射包括高速电子、X射线和射线:60Co-
干扰DNA合成,破坏细胞膜,产生游离基一次性医用塑料制品的消毒食品、药品、生物制品的消毒,不破坏其营养成分
(三)滤过除菌法
机制利用特殊的滤器以去除液体或空气中的细菌,以达到无菌目的。用途主要用于不耐高温无菌的血清、毒素、抗生素、药液,以及空气的除菌。特点仅能除去细菌,不能去除病毒、支原体、衣原体和有些L型细菌等。过滤除菌法用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去,达到无菌目的。除菌的滤膜孔径:0.22μm,可除去一般细菌。
1.滤菌器(filter):液体除菌
2.空气除菌:采用生物洁净技术用滤菌器过滤将液体或空气中的细菌除去。常用于不耐热血清、毒素、抗生素等的除菌。生物洁净室(图)在超净工作台上(四)超声波杀菌法机制:不被人耳朵感受的高于20千赫/秒的声波,称为超声波。由于超声波频率高,可裂解许多细菌,G-菌尤敏感,但裂解并不彻底。
用途:
主要用于粉碎细胞,提取细胞组分以及制备Ag,洗涤等。(五)干燥与低温抑菌法菌种保存:低温冰箱液氮罐冷冻真空干燥法-196℃低温冰箱三、化学消毒灭菌法(一)化学消毒剂的基本要求1.有效性:杀菌谱广,作用快速。2.安全性:无毒无味,无刺激,无致畸、致癌、致突变作用,使用安全。3.稳定性:性能稳定,便于储存和运输。类别作用机制常用种类酚类蛋白变性,细胞膜损伤石炭酸醇类蛋白变性乙醇氧化剂氧化、蛋白沉淀高锰酸钾重金属盐氧化、蛋白酶变性红汞、硫柳汞氧化剂氧化、蛋白沉淀过氧乙酸、碘酒表面活性剂蛋白变性,细胞膜损伤新洁尔灭染料干扰氧化、抑制繁殖龙胆紫(二)常用消毒剂种类和作用机制及用途种类使用浓度用途石炭酸3%~5%地面、器具表面、皮肤消毒乙醇70%~75%皮肤、体温计消毒高锰酸钾0.1%~0.5%皮肤、尿道、蔬菜、水果消毒红汞2%~5%皮肤、粘膜、小创伤消毒硫柳汞0.1%皮肤消毒、手术部位消毒过氧乙酸0.2%~0.3%塑料、玻璃器材消毒碘酒2%~2.5%皮肤消毒新洁尔灭0.05%~0.1%手术洗手、浸泡手术器械龙胆紫2%~4%浅表创伤消毒各种消毒剂的应用
化学消毒剂的杀菌机制①促进菌体蛋白质变性或凝固:如酚类、醇类、重金属盐类、酸碱类、醛类等。②干扰细菌的酶系统和代谢:如氧化剂、重金属盐类。③损伤细菌细胞膜或病毒包膜:如酚类、表面活性剂、脂溶剂等。(1)室内空气消毒灭菌
1.物理消毒法
①紫外线照射(1.5W/m3,1h)最常用;②滤过除菌:空气通过孔径小于0.2μm的高效过滤装置以除去细菌和带菌尘埃。
2.化学消毒法
包括化学消毒剂喷雾和熏蒸:①过氧乙酸喷雾、熏蒸;②过氧化氢喷雾;③二氧化氯溶液喷洒;④中草药点燃烟熏。消毒灭菌的运用(2)手和皮肤的消毒
用肥皂和流动水经常并正确洗手
病原微生物污染时应用消毒剂消毒。(3)黏膜的消毒:3%H2O2用于口腔粘膜消毒、0.01%-0.1%洗必泰或高锰酸钾用于冲洗尿道、阴道、膀胱等;1%硝酸银给新生儿滴眼以预防淋球菌感染。(4)病人排泄物与分泌物的消毒灭菌:一般用等量的20%漂白粉、5%石炭酸或2%来苏,搅拌均匀放2h。
(5)饮水的消毒:自来水用氯气、少量的饮水可用漂白粉。(6)环境的消毒
:厕所、阴沟:生石灰。(三)影响消毒灭菌效果的因素1.消毒剂的性质、浓度与作用时间2.微生物的种类、生理状态和数量3.温度及酸碱度4.有机物的存在1.常用于手术室、无菌室的消毒2.常用于基础培养基灭菌3.常用于牛奶、酒类的消毒4.常用于血清、抗毒素等制剂的除菌
5.常用于粉剂、油剂的灭菌A.
高压蒸汽灭菌法B.
紫外线照射法C.
巴氏消毒法D.
滤过除菌法E.
干热灭菌法1.B2.A3.C4.D5.E配伍题A.0.1%新洁尔灭(苯扎溴铵)B.1%硝酸银C.5%石炭酸D.甲醛与高锰酸钾混合物E.3%过氧化氢1.病人排泄物2.新生儿滴眼3.空气消毒4.术前洗手5.口腔黏膜消毒1.C2.B3.D4.A5.E配伍题第二节
生物安全(biosafety)
生物安全是指避免危险生物因子造成实验室人员伤害,或避免危险生物因子污染环境、危害公众的综合措施。生物安全相关事件:实验室感染
2004年,四级生物安全实验室俄罗斯研究员豚鼠实验被装有埃博拉病毒针头扎破手指14天后死亡2003年12月6日台湾一位研究员在操作过程中,装实验废弃物的塑料袋破裂,少量液体外流先喷酒精消毒,等10分钟后,误认病毒已死亡,便动手清理4天后发烧,意识到可能感染SARS不肯就医,担心暴露实验室缺失直到父亲以死相劝才就医1990年意大利Sassari学院布鲁氏菌培养物发生离心管爆裂共有12名实验室工人被感染潜伏期从6周到5个月不等2002年3月美国炭疽实验室工人感染皮肤炭疽该患者未接种过炭疽疫苗感染前右下颌有一开放性伤口炭疽株样本冷冻时未佩戴手套数天后该患者发病
2002年8月美国一微生物学家在BSL-2疑西尼罗河病毒感染的蓝鸟作尸解刀切除鸟大脑时拇指被划伤虽及时进行伤口清洁和包扎4天后发病并证实该病毒感染约2周后恢复1967年,德国研制疫苗从乌干达进口一批黑长尾猴引起了13名工作人员患病,并使这种疾病在德国马尔堡等地区流行这些猴子携带有一种特殊的病毒后命名为马尔堡病毒1961年在莫斯科实验人员从流行性出血热疫区捕捉一些野鼠带回实验室由于疏忽把野鼠放在室内暴露的场所过了不久,有63人出现发热等症状1周内又增30人,才怀疑流行性出血热人为破坏2001年以来在美国制造炭疽的恐慌事件造成几十人染病,数人死亡现已表明,来自美国军队生化实验室实验室泄漏引起感染及造成的社会危害
1979年4月苏联陶瓷厂的工人来到医院:病状是发烧、咳嗽、胸痛病情迅速恶化,几小时后,数人死亡事后得知,斯维尔德洛夫斯克生物武器实验室在4月3日夜里发生爆炸约10公斤的炭疽芽孢粉剂泄露爆炸释放大量细菌雾,造成附近1000多人发病,数百人死亡1979年设在俄罗斯叶卡捷琳堡微生物中心的地下试验场发生了炭疽菌的泄露造成350人发病,45人死亡214人濒临死亡发生于美国密执安州立大学羊布氏杆菌泄露,感染45人,1人死亡美国华盛顿国立卫生研究院的Q热实验室,导致153人发病,1人死亡国内实验室感染事件2004年4月安徽、北京先后发现新的SARS病例,经证实分别来自于在中国疾病预防控制所实验室受到SARS感染的两名工作人员。两名科研人员,采用未经论证的非典病毒灭活方法,在不符合防护要求的普通实验室内操作非典感染材料,造成北京、安徽发生非典疫情。
1998年我国某高校,汉坦病毒大白鼠进行流行性出血热试验两名学生被大白鼠咬伤另些学生给老鼠放血、解剖均未按照要求戴手套操作29名实验人员中造成9人感染携菌实验山羊“放倒”28名师生
省教育厅、省卫生厅、省疾控中心、省农垦总局总医院、医疗专家组、东北农业大学联合举行新闻发布会,通报东北农业大学28名师生因实验感染布鲁氏菌病感染事件的情况。据东北农大副校长冯晓介绍,目前除2名学生因骨关节少量积液、医院建议住院观察外,已有25名师生临床治愈、1名学生好转。东北农业大学承诺,在承担所有法律责任的基础上,赔偿每名学生约6.1万元。28名师生感染布鲁氏菌病2010年12月间,东北农业大学动物医学学院相关教师,使用了从哈尔滨市香坊区幸福镇纪家村青喜养殖场购入的4只山羊,共有4名教师、2名实验员、110名学生使用山羊进行了五次实验。经查实,相关教师在购买实验山羊时,未要求青喜养殖场出具相关检疫合格证明,同时实验前未对实验山羊进行现场检疫。此外,在指导学生实验过程中,未能严格要求学生遵守操作规程、进行有效防护。东北农大承担全部责任在调查基础上,学校认定此次事故是一起因学校相关教师在实验教学中违反有关规定造成的重大教学责任事故。承诺通过给予学生一次性补助3万元,以及免除一年学费6000元、毕业时提供创业基金1万元、给予营养费1万元、争取社会捐助5000元等形式,累计给予学生补助6.1万元。此外,在学生毕业时,学校将积极帮助推荐工作。
学校事故相关责任人处理对2名实验指导教师分别给予了降级、记大过处分,调离教师岗位;对2名实验员及另外1名实验指导教师分别给予了记大过、记过处分;停发上述5人本年度校内津贴和年终一次性奖金,两年内不得晋升专业技术职务,分别追偿经济责任1万~5万元人民币;免去了动物医学学院院长和院党总支书记职务。
病原微生物所致的安全问题,如病原微生物实验室的安全隐患、生物武器、生物恐怖、重大传染病的暴发流行等,也是人类社会所面临的最现实的生物安全问题。
病原微生物实验室生物安全的核心是防扩散和防感染。
(一)病原微生物实验室生物安全
(
一)病原微生物的危害程度分类根据传染性、感染后对个体或者群体的危害程度,分为四类:
第1类是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物,以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。如天花病毒,Ebola病毒,马尔堡病毒
第2类是指能够引起人类或者动物严重疾病,比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。如:Tb,HIV,鼠疫,炭疽,布氏,霍乱,SARS,立克次体第1类、第2类统称为高致病性病原微生物。一、病原微生物的分类第3类是指能够引起人或动物疾病,但一般情况下对人、动物或环境不构成严重危害,传播风险有限,实验室感染后很少引起严重疾病,并且具备有效治疗和预防措施的微生物。如:条件致病菌、肠道杆菌、肠道病毒,HBV
第4类是指在通常情况下不会引起人或动物疾病的微生物。如小鼠白血病病毒等。低个体危害,几乎无群体危害
(二)生物安全实验室的生物防护分级级别处理对象一级对人体、动植物或环境危害较低,不具有对健康成人、动植物致病的致病因子。二级对人体、动植物或环境具有中等危害或具有潜在危险的致病因子,对健康成人、动植物和环境不会造成严重危害,具有有效的预防和治疗措施。三级对人体、动植物或环境具有高度危险性,主要通过气溶胶使人类传染上严重的甚至是致命的疾病,或对动植物和环境具有高度危害的致病因子。通常有预防治疗措施。四级
对人体、动植物或环境具有高度危险性,通过气溶胶途径传播或传播途径不明或未知的危险的致病因子。没有预防治疗措施。生物安全水平分级(biosafetylevel,BSL)根据所操作生物因子的危害程度和采取的防护措施生物安全防护水平分4级:BSL-1,BSL-2,BSL-3,BSL-4实验室P1P2P3P4实验室一、二级实验室不得从事高致病性病原微生物实验活动。三级、四级实验室从事高致病性病原微生物实验活动。从事高致病性病原微生物相关实验活动应当有2名以上的工作人员共同进行。在同一个实验室的同一个独立安全区域内,只能同时从事一种高致病性病原微生物的相关实验活动。应有健全安全保卫制度。
BSL-1实验室危害等级I(低个体危害,几乎无群体危害)普通建筑物防节肢动物和啮齿动物进入
常规要求
①实验室有带锁的门;
②有洗手水槽;
③工作面易于清洁;
④天面不渗水;
⑤实验室台结实;生物安全2级(BSL-2)结构设计(二级防护)BSL-2实验室
危害等级Ⅱ(中等个体危害,有限群体危害)普通建筑物实验室内配备生物安全柜实验室所在建筑内应配高压蒸汽灭菌器生物安全柜:高效空气过滤器(highefficiencyparticulateairfilter,HEPA)通常以滤除≥0.3μm微粒为目的过滤器保护人体保护人体和防止操作材料污染I级生物安全柜由外向内的单向气流通过HEPA排气只保护人不被感染,不保护实验材料的污染(进气污染)II级生物安全柜由外向内的单向气流经HEPA垂直气流进气通过HEPA排气保护人不被感染和实验材料不被污染生物安全柜生物安全柜生物安全柜结构设计(三级防护)生物安全3级(BSL-3)美国CDC生物安全实验室BSL-3实验室
危害等级III(高个体危害,低群体危害)实验室:应在建筑物中自成隔离区(有出入控制)或为独立建筑物有II级或III级生物安全柜BSL-3(P3)备有四大防护性措施:①负压密闭实验室:处于完全密闭环境,进入空气不可能倒流②空气过滤:进入实验室的空气都是经过完全过滤的;排出的空气也必须经过消毒、过滤处理③人员必须遵守严格消毒程序规定:须穿隔离服和戴眼罩、口罩、手套等离开时须进行消毒处理、换装实验室废物及工作服等一律不能带出,在消毒合格后才能进行垃圾处理④实验操作都必须在生物安全柜中进行III生物安全柜III级生物安全柜全封闭型进气和排气都经HEPA保护人不被感染和材料不被污染III生物安全柜中国CDC病毒病预防控制所BSL-3实验室中国CDC传染病所BSL-3实验室福建省CDCBSL-3实验室武汉大学ABSL-3室江苏省CDCBSL-3实验室中国医学科学院医学实验动物所ABSL-3实验室上海市公共卫生临床中心BSL-3实验室云南省CDCBSL-3实验室中国医科大学艾滋病研究所BSL-3实验室复旦大学ABSL-3实验室中山大学医学院BSL-3实验室武汉大学
P3实验室P3实验室指生物安全三级实验室,用于研究烈性传染病,目前国内生物安全级别最高的实验室。P是protect(保护)的缩写。P3实验室1.签订知情同意书;2.要进行严格体检;3.培训中国实验室国家认可委员会26日宣布,向武汉大学的生物安全三级动物实验室颁发中国首张高级别生物安全实验室的国家认可书。
科研人员对灭活的SARS病毒液进行精提纯科研人员在观察灭活疫苗细胞生长情况移动式P3实验室
(每套设备价值近800万元)
P4实验室是指生物
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