原核表达系统的选择和高效表达策略(共43张PPT)

原核表达系统的选择和高效表达策略第一页，共43页。教学内容一、PCR引物的设计与实验操作技巧；

二、基因组文库的建立与筛选；

三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中的应用；

四、原核表达系统的选择和高效表达策略；五、真核表达系统的选择和高效表达策略。第二页，共43页。四、原核表达系统的选择和高效表达策略

原核生物表达系统主要包括：

大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等,其中应用最广泛的是大肠杆菌表达系统。第三页，共43页。原核表达系统的优点1、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉；2、外源基因表达产物的水平高(如大肠杆菌中目的蛋白的表达量可超过细菌总蛋白量的80%)；3、基因背景和表达特性清楚。第四页，共43页。大肠杆菌表达系统自20世纪70年代以来,大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尤其是进入后基因组时代以来,有关蛋白结构以及功能研究的开展,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。第五页，共43页。大肠杆菌表达系统的优缺点优点：大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、可以高效表达不同外源基因产物等特点,是许多外源基因表达系统中最好的一种,是目前研究最深入、发展也最完善的表达系统,大量的有价值的多肽和蛋白质已在大肠杆菌中获得了超量表达。缺点：大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比,也具有一些缺点:①高效表达易形成包涵体。②不能进行翻译后的加工修饰,如糖基化、磷酸化及酰基化等。第六页，共43页。大肠杆菌表达系统的操作流程

大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下：

获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。第七页，共43页。大肠杆菌表达系统的基本概念首先讲述一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。

第八页，共43页。大肠杆菌表达系统的基本概念复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。

筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢？大家“随便倒掉”已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？从以前的一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。

第九页，共43页。大肠杆菌表达系统的基本概念对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了（注意选择适用原核表达版本的GFP），其他还有半乳糖苷酶，荧光素酶等等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。

启动子、终止子和核糖体结合位点：

启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。

转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用——控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，分别是Rho因子作用下使mRNA转录终止的终止子和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA转录的终止子。常见的是rrnB

、rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。

第十页，共43页。大肠杆菌表达系统的基本概念

核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有，适合自带SD序列的基因表达，要留意。

第十一页，共43页。大肠杆菌表达系统的几种表达方式组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。

诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。

第十二页，共43页。大肠杆菌表达系统的几种表达方式融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。

分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包涵体，而且表达产物通常是可溶的活性状态，不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。

可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包涵体颗粒，包涵体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。第十三页，共43页。提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略大致有八种策略：（1）在细胞中表达分子伴侣（天然或异源），辅助新生肽链折叠，避免肽链相互聚合（例如Takara的ChaperoneplasmidSet）；（2）共表达折叠酶，催化共价键形成；（3）通过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度，以降低有聚合倾向的中间体的浓度；（4）选择中等强度或低强度的启动子代替强启动子，降低重组蛋白的合成速度；（5）选择适合的宿主菌株；（6）表达含可溶性多肽或信号肽的重组蛋白，提高可溶性；（7）蛋白质的可溶性往往与自身的氨基酸序列有关，因此可利用诱突技术改变其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；（8）诱导过程中加入化学物质，以增加渗透压或改变培养基的pH值。第十四页，共43页。大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子最早应用于大肠杆菌表达系统的是Lac乳糖操纵子，由启动子Plac、操纵基因lacO和结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。lacUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO

上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。第十五页，共43页。大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。第十六页，共43页。大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开启转录。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定。

第十七页，共43页。大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子以λ噬菌体载体转录启动子PL、PR构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30度下阻遏启动子转录，42度下解除抑制开发转录。同样的，PL、PR

表达载体需要携带cI857(ts)菌株作为表达载体，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因溶源化到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cI基因的表达，从而解除强大的PL启动子的抑制。

第十八页，共43页。大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7

RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7

RNA聚合酶，需要将外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA

聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。

第十九页，共43页。常用的几种大肠杆菌表达系统1、GE（原安玛西亚）-pGEX系列，特点：使用该系列载体可以很方便进行下一步重组蛋白的纯化。

第二十页，共43页。GE（原安玛西亚）-pGEX系列第二十一页，共43页。Invitrogen-Champion™pETExpressionSystem等四个系列比起其它公司的原核表达系列来说Invitrogen有个非常突出的地方就是它的重组克隆技术。像之前Novagen大部分载体都是用传统的酶切、链接方式做重组质粒，但是Invitrogen的表达系统大量运用了它的TOPO技术和Gateway技术。Invitrogen公司总共有四个原核表达系统它们分别是：Champion™pETExpressionSystem、HisPatchThioFusionSystem、pBADInducibleBacterialSystem、pLSystem和T7-basedSystems。这四个系列的载体可谓把原核表达的发展史中出现过的几种启动子都囊括进去了，包括T7、pL、pBAD和trc启动子，同时几种经典的调控方式也都出现了，包括有乳糖操纵子、色氨酸操纵子和阿拉伯糖操纵子。Champion™pETExpressionSystem之所以取了个冠军系统的称号是因为它结合了经典的T7表达系统和Invitrogen的王牌定向TOPO技术及Gateway技术，这可谓是强强联手。

第二十二页，共43页。第二十三页，共43页。第二十四页，共43页。InvitrogenpET100/D-TOPO载体图谱第二十五页，共43页。Novagen公司-pET表达载体序列Novagen公司（Merck的子公司）出品了多种原核表达载体系列，其中的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体。第二十六页，共43页。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体。大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。第三十五页，共43页。偏好的密码子（需要重新合成基因），第二十五页，共43页。启动子、终止子和核糖体结合位点：

启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。第三十五页，共43页。原核生物表达系统主要包括：现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。特别是在大量抽提过程中。解决途径之一即是选用两端都带有融合标签的pET载体，例如pET28和pET30序列载体。Novagen公司（Merck的子公司）出品了多种原核表达载体系列，其中的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。特别是在大量抽提过程中。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。Novagen公司的pET表达载体系列pETVectorswithuniquefeaturesinclude:pET-31b(+)forhighyieldbioproductionofpeptidesandsmallproteinspET-32a-cforproductionofsoluble,activetargetproteinsinE.coli

pET-33bforproductionoftargetproteinssuitableforsite-specific32P-labelingpET-39band40busingDsbtagsforexportandperiplasmicfoldingoftargetproteinspET-41a-cand42a-cwithpopularGSTfusiontagsforenhancedproductionandsolubilitypET-43.1a-cdesignedforcloningandhigh-levelexpressionofpolypeptidesequencesfusedwiththe495aaNusA(Nus•Tag™)proteinpET-44a-cwithNus•Tag™sequenceplusN-andC-terminalHis•TagsequencespET-45b(+)withamino-terminalHis•Tag™sequenceandminimalextraneoussequencespET-46Ek/LICpreparedvectorforligation-independentcloning,withamino-terminalHis•Tag™sequencepET-47b(+)throughpET-50b(+)withHRV3CProteasecleavagesiteforefficientfusiontagremovalAdditionalvectorsinthistableinclude:pLacI

pLysEandpLysS

第二十七页，共43页。Novagen公司的PET32a表达载体图谱第二十八页，共43页。Novagen公司的pET表达载体选择从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：1.与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathioneStransferase,GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）和N利用底物A蛋白（NutilizationsubstanceA,NusA）。2.转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。3.插入一个定位到周质空间的信号肽序列。以上载体都是采用抗生素抗性筛选，如果你希望用蓝白斑筛选可以使用pETBlue系列载体。在重组技术上，Novagen除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式：Ligation-Independentcloning，简称LIC。采用LIC方法的pET载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。第二十九页，共43页。Novagen公司的大肠杆菌菌株选择Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改造，它们大致分为以下几个种类：1.蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包括有B834,BL21,BLR,Origami™B,Rosetta™和Tuner™。因此在纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。BL21(DE3)是应用最多的表达的表达菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。它的缺失，可以保证质粒的稳定。2.保证所有细胞以同样量进行表达Tuner™株及它的衍生株（Origami™B和Rosetta™）是BL21菌株的lacY1缺失突变型，在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。Lac渗透酶的突变使进入每个细胞的IPTG量都是一致的，这样使蛋白表达浓度可以随着IPTG浓度而改变。通过对IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。一般说来，低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。第三十页，共43页。Novagen公司的大肠杆菌菌株选择3.二硫键形成与溶解性增强二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，Origami，OrigamiB和Rosetta-gami™。在这些菌株中表达蛋白，可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。4.稀有密码子的补给不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。Rosetta™是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。Rosetta系列是来自BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。5.硒蛋氨酸标记B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。它在高度特异活性35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。第三十一页，共43页。原核表达需要考虑的问题在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。第三十二页，共43页。大肠杆菌表达系统的高效表达策略1、采用高强度启动子-如T7启动子；2、将目的基因所有密码子都换成大肠杆菌偏好的密码子（需要重新合成基因），或采用含有大肠杆菌稀有密码子tRNA

的Rosetta系列菌株。3、采用丰富培养基（如TB）代替普通的LB培养基；4、优化大肠杆菌的生长条件和目的基因的诱导表达条件。第三十三页，共43页。使用pET表达系统的常见问题分析

几个常见问题如下表：第三十四页，共43页。原核表达常见的几个问题及回答（1）1、目的蛋白总是以不可溶的形式出现。解决办法：采用以下八种策略提高目的蛋白的可溶性。第三十五页，共43页。提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略大致有八种策略：（1）在细胞中表达分子伴侣（天然或异源），辅助新生肽链折叠，避免肽链相互聚合；（2）共表达折叠酶，催化共价键形成；（3）通过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度，以降低有聚合倾向的中间体的浓度；（4）选择中等强度或低强度的启动子代替强启动子，降低重组蛋白的合成速度；（5）选择适合的宿主菌株；（6）表达含可溶性多肽或信号肽的重组蛋白，提高可溶性；（7）蛋白质的可溶性往往与自身的氨基酸序列有关，因此可利用诱突技术改变其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；（8）诱导过程中加入化学物质，以增加渗透压或改变培养基的pH值。第三十六页，共43页。原核表达常见的几个问题及回答（2）2、必须去除融合多肽或蛋白质标签才能使目的蛋白获得活性吗？回答：大多数情况下目的蛋白带有His-Tag,S-Tag,11个氨基酸的T7-Tag或HSV-Tag等小肽时仍能表现出完全的活性。这些肽段都较为亲水，理论上都不会干扰蛋白的三维结构。我们建议首先测试蛋白活性，再看是否一定要去除前导序列才能适合特定的应用要求。第三十七页，共43页。原核表达常见的几个问题及回答（3）3、如果目的蛋白包含信号序列，它会不会被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在？还是目的蛋白甚至可以被分泌到生长培养基中？回答：如果目的蛋白包含ompT或pelB这样的前导序列，理论上它应该被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在。如果在生长培养基中发现目的蛋白的话，多半是因为细胞壁受到破坏，而并不代表蛋白是被分泌到培养基中的。除了信号肽对蛋白质的运输有影响，现在发现蛋白质的成熟区对蛋白质的运转也有影响。因此在细胞质、细胞周质及其它区域发现目的蛋白都很正常。某些情况下降低诱导时的培养温度至25-30℃，可能提高蛋白运输的比例。第三十八页，共43页。原核表达常见的几个问题及回答（4）4、IPTG诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？回答：T7RNA聚合酶非常活跃，T7转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。但也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体/宿主菌组合(比如含有plysE的宿主菌)等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。第三十九页，共43页。原核表达常见的几个问题及回答（5）5、除了毒性和降解，还有些什么因素会影响目的蛋白的表达水平？回答：（1）mRNA转录子中的二级结构会干扰AUG翻译起始密码子和/或核糖体结合位点。所有pET载体的转录产物都是下列两种之一：Rbs