免疫酶组织化学技术-免疫酶组织化学染色方法及操作

病理检验技术

免疫组化技术

免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学染色方法及操作免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学染色方法及操作

免疫组化染色方法有多种,临床病理诊断要求使用敏感性高和特异性强的免疫组化技术方法。近年来,由于抗体制备技术不断地改进和提高,不同公司生产的检测试剂盒,在特异性和敏感性方面各有特点,各实验室可以根据自己的实际情况,合理选用。

免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学技术---方法

（一）EnVision法1.特点EnVision法为采用聚合物技术的二步法,是非生物素检测系统,可避免内源性生物素干扰,不需要进行封闭内源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封闭,具有敏感性高,操作简便和非特异性染色少的优点,已成为最常用的方法之一(图49)。免疫酶组织化学技术---方法2.试剂盒只

有EnVision/HRP/抗鼠/抗兔二抗工作液。不同编号的试剂盒有所不同，有的还配有过氧化物酶阻断剂和显色剂。也可选择EnVision/AP/抗鼠/抗兔二抗。3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水。冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)3%的H2O2水溶液处理10分钟,蒸馏水洗,PBS洗5分钟。(4)滴加一抗工作液,孵育30~60分钟,37℃；或孵育过夜(约16小时),4℃。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)滴加EnVision/HRP/鼠/兔二抗,孵育10~30分钟,37℃。(7)PBS洗5分钟,3次。(8)DAB-H2O2显色1~5分钟,蒸馏水洗终止显色。(9)Mayer苏木精染色液复染细胞核3~5分钅钟,蒸馏水洗5~10分钟。(10)常规脱水透明,中性树胶封片。4.结果

阳性结果呈深浅不一的棕色,细胞核呈蓝色。免疫酶组织化学技术---方法LSAB(S-P)法1.特点LSAB法采用链菌抗生物素蛋白-生物素技术,其中链菌抗生物素蛋白与生物素具有很强的亲和力,三步法染色,加入的二抗和三抗可将抗原-抗体结合物不断放大,敏感性较高。高纯化的抗体技术,使背景更加清晰。为含生物素检测系统,需注意封闭内源性生物素。二抗含有抗鼠、抗兔和抗羊免疫球蛋白,适用于与鼠抗、兔抗和羊抗等一抗配套使用。价格较便宜(图4-10)。免疫酶组织化学技术---方法2.试剂盒

包含生物素标记的抗鼠/抗兔/抗羊免疫球蛋白(biotin-mouse/rabbit/goatlgG)工作液,标记HRP的链菌抗生物素蛋白(streptavidin/HRP)工作液。不同编号的试剂盒有所不同,有的还配有过氧化物酶阻断剂和显色剂。也可选择标记AP的链菌抗生物素蛋白(streptavidin/AP)。3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水。冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)3%的H2O2水溶液处理10分钟,蒸馏水洗,PBS洗5分钟。(4)正常血清封闭后直接滴加一抗工作液,孵育30~60分钟:或孵育过夜(约16小时)。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)滴加鼠/兔/羊二抗,孵育20~30分钟,37℃。(7)PBS洗5分钟,3次。(8)滴加链菌抗生物素蛋白/HRP(三抗),孵育20~30分钟,37℃。(9)PBS洗5分钟,3次。(10)DAB-H2O2显色1~5分钟,蒸馏水洗终止显色。(11)Mayer苏木精染色液复染细胞核3~5分钟,蒸馏水洗5~10分钟。(12)常规脱水透明,中性树胶封片。4.结果

阳性结果呈深浅不一的棕色,细胞核呈蓝色。免疫酶组织化学技术---方法(三)EPOs法1.特点EPOS法采用聚合物技术的一步法,敏感性高。一抗不含生物素,可避免内源性生物素干扰,不需要进行封闭内源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封闭。最大的优点是操作步骤少,染色快速,几乎没有非特异性背景染色。缺点是抗体种类不多,一抗只有标记HRP(图4-11)。免疫酶组织化学技术---方法2.试剂盒

不用检测试剂盒,只需要选用EPOS一抗即可。3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水。冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)3%的H2O2水溶液处理10分钟,蒸馏水洗,PBS洗5分钟。(4)滴加一抗工作液,孵育45分钟,37℃。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)DAB-H2O2显色1~5分钟,蒸馏水洗终止显色。(7)Mayer苏木精染色液复染细胞核3~5分钟,蒸馏水洗5~10分钟。(8)常规脱水透明,中性树胶封片。4.结果

阳性结果呈深浅不一的棕色,细胞核呈蓝色。免疫酶组织化学技术---质量控制1.组织离体后应及时固定,最理想的固定液为10%的中性缓冲甲醛液(pH7.2~7.4)固定时间为4~6小时,不超过24小时。固定不足或过度固定都不利于免疫组化染色。2.石蜡切片脱蜡要彻底,脱蜡不干净会造成局灶性阳性等染色不均匀的现象,甚至染色失败。3.是否进行抗原修复,可参考一抗说明书或实验室预实验结果来定。许多抗原检测进行抗原修复时,可以用热处理方法替代蛋白酶消化方法。不当的抗原修复会导致抗原定位发生改变,即应该细胞质阳性的则出现细胞核阳性等；也会引起假阳性或假阴性的结果。4.使用的二抗为HRP/鼠/兔,不需要考虑所用的一抗是鼠抗还是兔抗。5.在临床病理学诊断时,是否需要行免疫组化染色作为辅助诊断,如需要,选用多少种抗体,用哪一种抗体和哪一种克隆的抗体由诊断医师来决定。但技术员应了解和记录同种抗体中染色效果最好的厂牌和批号,每次使用新批次的抗体,都应该先做预实验来检测抗体的效价。如果更换不同类型的检测试剂盒,因敏感性不同,一抗的稀释度或一抗的孵育时间有可能不同,即使是即用型一抗都有可能需要稀释。一抗稀释度越大,背景染色越少,所以应选用较敏感的检测试剂盒,以提高一抗的稀释度。6.不同试剂盒标记的酶可能不同,应合理选用，与一抗和显色剂的配套使用。在HRP系统,可用AEC代替DAB显色,阳性结果呈深浅不一的红色。在AP系统可选用固蓝或固红显色剂,阳性结果呈深浅不一的蓝色或红色。除DAB显色外,用其他显色剂显色后,都不能用乙醇脱水,二甲苯透明和中性树胶封片,只能用水溶性胶封片,而且不能长时间保存切片。除非行双重染色,一般应首选DAB为显色剂(表4-3)。免疫酶组织化学技术---质量控制免疫酶组织化学技术---质量控制7.手工染色时,抗体孵育切片应在37℃进行,使每次染色抗体孵育都能在恒定的温度下进行,不受室温的影响。在低温如4℃进行第一抗体孵育切片,时间可以延长至16~24小时,通常是过夜,更有利于与抗原抗体充分结合。8.滴加抗体要完全覆盖组织。在加抗体前用含0.05%吐温的PBS浸洗切片,可有效避免由于抗体表面张力的作用,在组织表面隆起而引起组织边缘出现假阳性的现象。9.加抗体前后均应用PBS充分浸洗切片,不必担心过多浸洗使抗原-抗体结合物解离。一般用3缸PBS,并保证第3缸PBS是新的,有利于减少非特异性染色。10.加抗体前要尽可能甩干切片上的PBS,残留的PBS对加入的抗体稀释度是很高的,会直接影响染色结果。11.在整个染色操作过程中,应避免切片完全干燥,否则会增加背景色和导致染色失败。12.染色过程中设立阳性和阴性对照非常重要,以验证抗体和检测试剂系统效价是否稳定,实验操作是否正确,从而确保染色结果的可靠性。用于阳性对照的组织蜡块和组织切片要注意经常更新,组织蜡块和组织切片保存一段时间后,有可能会出现组织抗原的丢现象。免疫酶组织化学技术---质量控制13.Mayer苏木精染色液仅着染细胞核,所以不用酸分化。如果阳性定位在细胞核,复染要稍浅。如果用甲基绿复染,细胞核呈绿色。滴加甲基绿前要将切片上的水分甩干,有利于细胞着染。14.组织切片背景深与下列因素有关,应注意避免。(1)第一抗体浓度太高。(2)抗体孵育时间过长。(3)抗体孵育温度过高。(4)DAB显