2018年四川省临检中心临床微生物检验培训班 10-张杰-细菌形态学检查及质量保证

细菌形态学检查及质量保证四川省医学科学院

四川省人民医院

张杰正确诊断是抗感染合理用药的前提●非感染性炎症不需要进行抗感染治疗●不同病原体感染需要不同抗病原药物感染性疾病临床诊断相对容易，但病原诊断明确不容易，缺少最直接的病原学证据，抗感染目标治疗缺失2011年世界卫生组织（WHO）对临床微生物实验室提出三项指导性方针：•

临床微生物实验室尽可能把目标集中在快速诊断方面•

显微镜检查对建立快速的初步诊断具有很大价值•

实验室人员必须主动与临床结合，将实验室数据转化为临床有用的信息显微镜检查对建立快速的初步诊断具有很大价值关注微生物检验报告的时效性问题直接涂片、显微镜检查•

操作最简单•

费用最低•

用时最短•

结果最直观第一时间报告镜下所见，医生据此初步做出诊断，针对性用药。实验室与临床结合，将实验室数据转化为临床有用信息实验室与临床结合，将实验室数据转化为临床有用信息主要内容标本处理痰液:棉签挑取干酪样或脓性痰部分0.05-0.1ml,均匀涂抹成卵圆形痰膜（约2cm长)最有可能揭示病原体的那部分。每张玻片只涂一份标本脓痰粘液样痰唾液or诱导痰带血痰标本处理痰液:棉签挑取干酪样或脓性痰部分0.05-0.1ml,均匀涂抹成卵圆形痰膜（约2cm长)最有可能揭示病原体的那部分。每张玻片只涂一份标本脓液:同痰涂片法大便：取粘液便或者血便少量均匀涂布玻片，不可过厚无菌体液、脑脊液：离心或甩片集菌后涂片备用1）标本量少

直接取标本涂片2）标本足量

大于1毫升，甩片或离心涂片（3000r/min,15mim)标本处理痰液:棉签挑取干酪样或脓性痰部分0.05-0.1ml,均匀涂抹成卵圆形痰膜（约2cm长)玻片只涂一份标本脓液大便无菌片，不可过厚涂片备用1）标本量少

直接取标本涂片2）标本足量

大于1毫升，甩片或离心涂片（3000r/min,15mim)病灶组织或干酪块等:

先用组织研磨器磨碎后再行涂大小、厚度同痰涂片注意丝状真菌制片质量控制✓

涂片的厚薄以镜下见到单层细胞为宜✓

染色结果以细胞核、浆清晰，胞内吞噬物清楚可见✓

革兰染色阴、阳性分明为佳。涂片的制备水平及染色的质量，直接影响到镜检的结果制片标本处理压片固定拉片染色以打圈的方式反复涂抹均匀，避免标本涂布不均影响结果判读染色方法根据检测目标的不同选择最适合的染色方法，寻找病原菌蛛丝马迹病原体染色方法细菌、真菌真菌革兰染色10%KOH、乳酸酚棉蓝墨汁染色隐球菌结核分枝杆菌奴卡菌抗酸染色、荧光染色弱抗酸染色耶氏肺孢子菌细胞壁缺陷菌其他六胺银染色吖啶橙染色PAS、HE染色等革兰染色干后加热固定，涂片膜朝上以中等速度过火焰3次即可（温度不能过高，以防菌体蛋白变性，影响结果判断）。也可用乙醇或甲醇固定初染媒染脱色复染油镜观察结晶紫10s碘液10s95%酒精10s稀释复红10s革兰染色✓

涂片的厚薄注意取材✓

染色时间的把握,尤其是脱色时间，脱色不宜过度✓

固定过程不可用酒精灯过度加热，避免过热使菌体变性而影响染色效果✓

染液用完后应及时盖上盖子，以免挥发影响染色效果✓

被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如培养时间过长革兰阳性菌可能染成阴性，所以被检菌的菌龄一般最好在18h-24h之内。✓

某些细菌存在染色困难、不易脱色等情况，可能会出现染色不均，阴阳不定的现象（如某些G+b，鲍曼不动杆菌等）。拉丝实验（3%-5%KOH）抗酸染色石碳酸复红火焰微热至出现蒸汽5min盐酸乙醇脱色1min亚甲蓝染液复染，1min抗酸染色石碳酸复红火焰微热至出现蒸汽5min盐酸乙醇脱色1min1min弱抗酸染色✓

涂片干燥固定，用第1液（石碳酸复红）染5min，水洗✓

用1%硫酸脱色3min，水洗✓

用0.3%亚甲基蓝染色3-5min，水洗，吸干水分，自然干燥✓

结果：抗酸或弱抗酸杆菌呈红色，背景及非抗酸菌呈浅蓝色✓

每张玻片只能涂一个标本，以免染色过程中因冲洗使菌落脱落，造成阴阳性结果混淆✓

脱色时间依据涂片厚薄适当调整，以无红色为止✓

脱色时间过长也可能造成“影子”细菌，遇到此种情况因防止漏检，重新染色✓

注意生物安全，自我防护墨汁染色✓标本（脑脊液）离心取沉淀涂片，在标本涂片处滴加1滴墨汁✓加盖玻片✓在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，转高倍镜或油镜确认✓结果：新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，细胞壁明显，有时有出芽现象，背景为黑色墨汁染色注意事项✓

脑脊液与墨汁最适比例✓

脑脊液一定要离心15-30min✓

痰液、支气管灌洗液均可作为隐球菌检测的标本，防止漏检瑞士染色✓

涂片、自然干燥✓

滴加瑞氏染液染1min✓

加等量pH6.4的磷酸盐缓冲液(或等量超纯水)轻轻晃动玻片，室温静置5-10min✓

水洗、吸干、镜检✓

结果

细菌染成蓝色，组织细胞的细胞胞浆呈红色，细胞核呈蓝色，嗜酸颗粒染成橘红色瑞氏染色注意事项✓涂片厚薄适宜，涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中宜脱落✓所加染液不能过少，以免蒸发而使染料沉淀，冲洗时间不能过久✓染色对PH十分敏感，稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应接近中性，否则易造成染色异常，形态难以辨认乳酸酚棉兰染色✓在玻片上滴1滴乳酸酚棉蓝染色液✓用剪刀剪一段约1CM长的透明胶带，将一边贴在棉拭子木棒的一端，形成旗帜样✓将胶带粘性一面按在菌落表面，将菌丝粘在胶带上并平放入乳酸酚棉兰染液中，取下木棒，在胶带表面再滴加1滴乳酸酚棉兰，盖上盖玻片✓使用光学显微镜在低倍、高倍或油镜下观察真菌形态✓注意：制片一定要在生物安全柜中进行胶带一定在玻片上拉平整，以免起皱影响观察效果乳酸酚棉蓝染色曲霉毛霉治疗：伊曲康唑伏立康唑治疗：泊沙康唑卡泊芬净六胺银染色✓染色步骤：1）1％高碘酸滴于已固定好标本玻片，氧化10min，流水冲洗。2）2％铁明矾染10min，流水冲洗。3）玻片放入60℃预热20min的工作液中40min左右，每5min观察一次，至玻片上印片处呈淡褐色即可，流水冲洗。4）0.2％氯化金调色3～5min，流水冲洗。5）2％硫代硫酸钠固定3min，流水冲洗。6）置60℃烤箱内烤干，封片。以上操作均在室温下进行✓结果：油镜下观察，肺囊虫包囊，呈圆形、椭圆形或不规则形，包囊染成黑色六胺银染色✓肺孢子虫不能常规培养检测,主要开展组织学染色法✓GMS

方法是目前最好的组织学染色方法，对卡氏肺孢子虫的胞囊壁进行染色✓原理:通过铬酸氧化真菌细胞壁成分而产生乙醛基团来还原银离子✓标本种类:肺泡灌洗液,肺泡冲洗液,痰液经支气管镜活检物,胸腔纵隔淋巴结活检物,经肺穿刺活检物✓结果:肺孢子菌------黑色涂片背景----------绿色质量控制✓革兰染色：用培养24小时的ATCC25923（金黄色葡萄球菌）和ATCC25922（大肠埃希菌）于肉汤中混匀。高压灭菌，涂片，保存。✓抗酸染色：用ATCC14468（耻垢分枝杆菌）✓每天质控和标本同步进行染色方法革兰染色质控菌株阳性紫色阴性红色ATCC25923（金黄色葡萄球菌）ATCC25922（大肠埃希菌）ATCC14468（耻垢分枝杆菌）ATCC25922（大肠埃希菌）ATCC700603（肺炎克雷伯菌）抗酸染色墨汁染色红色蓝色有荚膜革兰染色质控片墨汁染色质控片人员比对✓人员比对程序✓人员之间试验项目比对表✓人员比对分析报告人员比对——人员比对程序人员比对——人员比对程序人员比对——人员之间试验项目比对表人员比对——人员比对分析报告✓标本合格与否的判定✓感染的确认（炎症细胞）✓炎症性质鉴别（单核、分叶核细胞或嗜酸细胞等）✓感染性质鉴别（细菌、真菌、螺旋体、寄生虫等）✓微生态失衡与否及程度（菌群失调）✓可疑致病菌的确认（根据微生物与炎性细胞的关系判定）判断标本合格与否判断标本是否合格，主要指开放性标本，如痰、尿及伤口标本。标本涂片、染色、镜检，根据细胞的种类、数量以及细菌的种类，来判断标本是否受常居菌群的污染及污染程度。如何判断您送检的一份痰液标本是否合格：肉眼观察标本的性状：粘稠、脓性、血性脓痰粘液样痰带血痰唾液or诱导痰示例：痰液标本镜检结果：（建议：每一份痰培养同时开具涂片申请）上皮细胞<=10/LP

白细胞>=25/LP

或上皮细胞：白细胞<=1:2.5涂片报告：查见G+C链/堆

2+查见G+b

3+查见G-b

3+查见真菌孢子及菌丝1+上皮细胞

60/LP白细胞

10/LP示例：痰液标本镜检结果：（建议：每一份痰培养同时开具涂片申请）上皮细胞<=10/LP

白细胞>=25/LP

或上皮细胞：白细胞<=1:2.5涂片报告：涂片报告：查见G+C链/堆

2+查见G+b

3+查见G-b

球杆状

4+上皮细胞

5/LP白细胞

80/LP查见G-b

3+查见真菌孢子及菌丝1+上皮细胞

60/LP白细胞

10/LP炎症性质鉴别中性粒细胞：分叶核细胞增多，意识着细菌或真菌感染的可能行增大。炎症性质鉴别嗜酸性粒细胞：过敏性炎症嗜酸性粒细胞性肺炎：是一种罕见、严重的疾病，表现为嗜酸性粒细胞充满肺组织。症状：发热、咳嗽、气促和呼吸困难。可导致进行性呼吸衰竭。如不能及时诊断、给予恰当治疗，很可能致命。某些药物可引发嗜酸性粒细胞性肺炎区分致病菌和污染菌✓

了解标本取材情况✓

了解标本取材部位附近的常居菌群✓

了解人体各部位的微生态资料和数据✓

了解所在医院环境微生态的资料和数据✓

了解医院细菌耐药监测数据区分致病菌和污染菌✓

了解标本取材情况✓

了解标本取材部位附近的常居菌群✓

了解人体各部位的微生态资料和数据✓

了解所在医院环境微生态的资料和数据✓

了解医院细菌耐药监测数据强烈提示致病菌感染的镜下现象“吞噬包裹伴行”现象：镜下可见细菌（或真菌）被炎性细胞吞噬或伴行，或被炎性细胞所包裹。多种细菌具有抗吞噬能力：肺炎链球菌、产荚膜的流感嗜血杆菌、产荚膜的肺炎克雷伯菌、产生物膜的铜绿假单胞菌、粘液型不动杆菌等等，是无法看到吞噬现象的。中性粒细胞浸润吞噬异物是人体重要的非特异性免疫防护机制

：被特异性免疫活化后的巨噬细胞杀伤能力增强，可转变为完全吞噬，例如巨噬细胞功能显著增强，可促进结核菌隐性感染的康复。吞噬现象伴行现象未被炎性细胞包裹的病原菌分布在炎性细胞周围者，需要区别于污染菌包裹现象有些病原微生物自身具有抗吞噬能力（如荚膜等），炎性细胞不能将其吞噬，而是将其包裹起来，形成脓球。临床标本涂片结果解读示例脓液

涂片报告革兰染色：查见G+c

链状

2+备注

WBC

大量引流液涂片报告革兰染色：查见G+c双/链

4+WBC大量尿液涂片报告革兰染色：查见真菌孢子

镰刀状备注

未查见WBC抗菌治疗效果观察革兰阴性杆菌在经过β-内酰胺类药物治疗的过程中，菌体会呈L型变化，这是药物对细菌作用的结果。在显微镜下可观察到这个现象。细菌与真菌涂片镜检和培养结果报告规范专家共识1.检验项目：主要说明检查项目、标本、检查对象的对应关系。如：粪便标本常规不进行革兰染色，特殊情况下可进行（如查找弯曲菌）。2.微生物学检查结果：主要说明针对微生物本身的报告格式、标准。如：•

阴性：XX染色，未见菌体；见/未见细胞或细胞名称、特征、数量。•

阳性：XX染色，查见菌体，描述菌体特征、数量及细胞学。•

具体标本、菌体另有特征时，均需详细描述。•

细菌革兰染色：报告每种菌体的形态（杆菌、球菌、球杆菌）、染色特征（阳性、阴性或不确定）、排列（双球菌、四联、八叠、短链或长链、葡萄状、柴捆状等）、半定量、比例。革兰染色抗酸染色弱抗酸染色酚棉蓝染墨汁染色六胺银染色建议：对大家公认为有临床致病意义的细菌：结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、诺卡菌、白喉棒状杆菌、隐球菌等一经检出就必须报临床。对来自无菌部位标本并排除污染的镜下细菌一经检出就必