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文档简介

生物技术及应用专业教学资源库溶菌酶的制备及其性质鉴定实验实验原理溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。鸡蛋清内含有丰富的溶菌酶，向鸡蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌酶的等电点，溶菌酶即可结晶析出。如若结晶不纯，可以重结晶。实验原理溶菌酶之所以溶菌，因它能催化革兰氏阳性细菌细胞壁黏多糖水解的缘故。测定溶菌酶的活力，可以用某些细菌细胞壁作为底物，以单位时间内被它水解的细胞壁的量表示酶活力的大小。实验步骤一、溶菌酶的提纯结晶（1）将2只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中，慢慢搅拌5分钟，使蛋清稠度均匀，然后用两层纱布过滤除去卵带或碎蛋壳，记录蛋清体积。（2）按每100ml蛋清溶液加入5g氯化钠的比例，向蛋清溶液中慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅拌，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。实验步骤（3）加完氯化钠细粉后，再用1mol/L的氢氧化钠溶液小心地将上述蛋清溶液的PH值调节到9.5-10.0。低温下静置7d，溶菌酶结晶将慢慢析出，于72-96h达到最高产率。（4）将结晶溶液4000r/min，离心5min，倾去上清液，加入等体积预冷0℃丙酮，再4000r/min，离心5min，洗涤后弃去上清液，即可得到粗制的溶菌酶晶体。实验步骤二、溶菌酶的活力测定（1）酶液的制备准确称取溶菌酶样品100mg，用0.1mol/L，pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml。（2）将酶液2mL和底物悬液2mL（短小芽孢杆菌）分别置于25℃水浴中保温10-15min，然后吸取底物悬液4mL放入比色皿中，450nm波长读出吸光度，此为0时读数。1min后，再读吸光度，记下读数。（3）酶活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分钟引起吸光度下降0.001为1个活力单位。实验步骤P={(A0-A1)/m}*1000P：每毫克酶的活力单位（U/mg）A0：零时450nm处的吸光度A1:1min时450nm处的吸光度m：样品的质量（mg）实验结果1、计算出溶菌酶的活力单位2、

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