未知基因验证

现在，研究人员开发出一种在酵母中分析这种基因功能的新方法。研究人员用一种可热诱导的“Degron来标记一个目标蛋白，标记物使得该蛋白在37摄氏度易发生蛋白水解，而且，当一个重要蛋白在活体中被破坏时，可对由该蛋白功能损失所产生的结果进行判别。研究人员采用这种方法来筛选细胞周期演进中的缺陷，在酵母中识别出三种DNA复制因子。双链RNA对基因表达的抑制及其应用细胞中存在的绝大多数RNA分子都是单链的，在遗传信息传递及蛋白质合成过程中发挥作用。DsRNA通常是感染细胞的病毒在复制过程中RNA合成的中间产物或一些DNA序列两条互补链转录产物相互结合的副产物。早期的研究揭示dsRNA会通过干扰素途径诱导产生一种蛋白激酶从而抑制被感染细胞中的蛋白质合成，但并不清楚dsRNA如何影响受感染细胞的正常基因表达及其功能。RNAi（RNAinterference）是指外源性双链RNA（dsRNA）能抑制细胞内与其序列同源的基因的表达，在进化上，这可能是生物调控基因表达及抵御病毒侵染或转座子诱导DNA突变的一种共有的生理机制。自1998年Fire证明RNAi可被应用于研究线虫基因的功能以来，已取得了巨大的进展。尤其是在人类及小鼠基因组计划相继完成，研究的重心已从大规模测序阶段转移到功能基因组的背景下，我们面临的是如何诠释这些遗传信息、如何将这些序列信息与生物学功能关联起来。而RNAi为我们研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段，同时在人类基因治疗方面具有潜在的应用价值。在未知功能基因的研究中，常用的反向遗传学手段包括基于同源重组的基因敲除及利用负链RNA与同源mRNA通过碱基互补结合，从而阻止其翻译或触发降解机制的反义RNA抑制两种手段，并都已成功地应用于一些功能基因的研究。但这两种方法都不能完全满足日益增长的研究需求。如，基因敲除能从根本上消除目标基因的活性，是经典的反向遗传学手段，但由于常规的基因敲除试验需要：（1）构建含突变位点的目标基因载体；（2）导入胚胎干细胞（ES）细胞；（3）筛选含重组构件的ES细胞；（4）将上述ES细胞注入囊胚腔；（5）通过嵌合体F1代自交以产生带突变纯合体的F2代，这往往需要几个月的时间，不利于在短期内研究数量较多的未知功能基因。同时，若希望一次性敲除两个或多个基因，对于基因敲除也是一大难题。此外，若希望研究某一突变致死基因在特定胚胎发育阶段的功能，基因敲除可能也无法满足研究的需求，因为胚胎可能在早期就因为缺失此基因而死亡。在某些制造基因敲除动物模型十分困难或因伦理学原因根本就不可能进行的物种中（如大型动物及人），基因敲除也无法应用。对于反义RNA抑制手段，虽然应用于果蝇中已取得了较好的效果，但在爪蟾Xenopus）、斑马鱼（Zebrafish）及小鼠胚胎中反义RNA不能稳定可靠地降低目标基因（例如Mos，Plat）的表达。同时，由于反义RNA技术对内源性基因表达的抑制较弱，往往产生过渡性的表型，这也妨碍了我们对目标基因功能的准确判断。RNAi可以有效地弥补基因敲除与反义RNA抑制的不足。由于RNAi作用比反义RNA技术更有效，更持久；比基因敲除更省时，可在短期内对多个基因进行研究（如探讨与果蝇已知序列染色体上所有开放阅读框相关联的表型）；通过导入多种dsRNA，可以研究一系列基因的功能及他们之间的相互关系，特别是研究母源性mRNA对卵母细胞及胚胎后继发育的影响具有其他方法无法比拟的优势，因此具有广阔的应用前景。最近，Elbashir使用21bpdsRNA避免了干扰素引起的细胞非特异性应激反应，实现了在一系列哺乳类细胞系中，包括人类Hela及胚胎性肾细胞系293中dsRNA对特定基因表达的抑制作用，进一步扩大了RNAi的应用范围，并为利用dsRNA进行基因治疗提供了实验依据。尽管许多基因RNAi的表型与其基因敲除后的表型吻合得很好，但RNAi并不适用于所有的基因，如dsRNA对一些在神经细胞中发挥功能的基因抑制作用不明显。同时，dsRNA会抑制细胞内所有具序列同源性的基因表达，因此与RNAi相关联的表型可能反映了一个基因家族中几个高度相关的基因缺失所导致的共同表型，而不仅仅是某一个特定的基因。此外，一些不相关基因也有可能因为局部序列的相似性而成为dsRNA的抑制作用对象。但上述问题都可以通过合理的dsRNA设计加以克服。此外，虽然dsRNA能有效抑制目标基因的表达，但必须意识到dsRNA的抑制作用是在转录后水平上实现的，并不是完全的。因此，RNAi作用后，一些基因依然可能保持低水平的基因表达。在研究未知基因的功能时必须考虑到RNAi的这些特点。问题与展望dsRNA能特异性抑制同源基因表达的发现引起了越来越多研究者的兴趣。目前对于RNAi的作用机制已有了较深入的认识，但依然有许多方面尚不明了，如介导降解mRNA的核糖核蛋白复合物(RNP)的构成及其行使功能的机制，rde-1和rde-4在dsRNA降解及小片段dsRNA传递到RNP过程中如何行使其功能，及推测中的螺旋酶尚未得到鉴定等等。然而，这并不妨碍RNAi成为研究线虫功能基因组的有力手段之一，并已被越来越多的实验室应用于未知基因功能的研究。当前，人类的基因组计划已完成，而另一个重要的模式动物-小鼠基因组计划也即将完成，RNAi无疑可以在这些物种的大规模功能基因组的研究中发挥重要的作用。目前越来越多的基因测序工作已完成，接下来的问题是这些基因的功能是什么、不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程、基因表达的调控、基因与基因产物之间的相互作用、以及相同的基因在不同的细胞内或者疾病和治疗状态下表达水平等等。因此，在人类基因组项目后，转录组的研究迅速受到科学家的青睐。转录组学(transcriptomics)就是在基因组学后新兴的一门学科，即研究细胞在某一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数。以DNA为模板合成RNA的转录过程是基因表达的第一步，也是基因表达调控的关键环节。所谓基因表达，是指基因携带的遗传信息转变为可辨别的表型的整个过程。转录组就是转录后的所有mRNA的总称。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。人类基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有5万个基因转录成mRNA分子，转录后的mRNA能被翻译生成蛋白质的也只占整个转录组的40%左右。通常，同一种组织表达几乎相同的一套基因以区别于其他组织，如：脑组织或心肌组织等分别只表达全部基因中不同的30%而显示出组织的特异性。转录组谱可以提供什么条件下什么基因表达的信息，并据此推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。通过这种基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。例如：阿尔茨海默病(Alzheimer'diseases,AD)中，出现神经原纤维缠结的大脑神经细胞基因表达谱就有别于正常神经元，当病理形态学尚未出现纤维缠结时，这种表达谱的差异即可以作为分子标志直接对该病进行诊断。同样对那些临床表现不明显或者缺乏诊断金标准的疾病也具有诊断意义，如自闭症。目前对自闭症的诊断要靠长达十多个小时的临床评估才能做出判断。基础研究证实自闭症不是由单一基因引起，而很可能是由一组不稳定的基因造成的一种多基因病变，通过比对正常人群和患者的转录组差异，筛选出与疾病相关的具有诊断意义的特异性表达差异，一旦这种特异的差异表达谱被建立，就可以用于自闭症的诊断，以便能更早地，甚至可以在出现自闭症临床表现之前就对疾病进行诊断，并及早开始干预治疗。转录组的研究应用于临床的的另一个例子是可以将表面上看似相同的病症分为多个亚型，尤其是对原发性恶性肿瘤，通过转录组差异表达谱的建立，可以详细描绘出患者的生存期以及对药物的反应等等。目前用于转录组数据获得和分析的方法主要有基于杂交技术的芯片技术包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，基于序列分析的基因表达系列分析SAGE(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)和大规模平行信号测序系统MPSS(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)。1991年Affymetrix公司在Southernblot基础上，开发出世界上第一块寡核苷酸基因芯片，自此微阵列技术(基因芯片)得到迅速发展和广泛应用，已成为功能基因组研究中最主要的技术手段。但是芯片无法同时大量地分析组织或细胞内基因组表达的状况，而且由于芯片技术需要准备基因探针，所以可能漏掉那些未知的、表达丰度不高的、可能是很重要的调节基因°SAGE是近年来发展的以测序为基础的分析特定组织或细胞类型中基因群体表达状态的一项技术。其显著特点是快速高效地、接近完整地获得基因组的表达信息。SAGE可以定量分析已知基因及未知基因表达情况，在疾病组织、癌细胞等差异表达谱的研究中，SAGE可以帮助获得完整转录组学图谱、发现新的基因及其功能、作用机制和通路等信息。MPSS是对SAGE的改进，它能在短时间内检测细胞或组织内全部基因的表达情况，是功能基因组研究的有效工具。因其需要配套的软硬件较为昂贵，目前国内外的相关应用报道不多。MPSS技术对于致病基因的识别、揭示基因在疾病中的作用、分析药物的药效等都非常有价值，该技术的发展将在基因组功能方面及其相关领域研究中发挥巨大的作用。功能基因筛选的基本策略功能基因筛选研究的基本策略包括:(1)通过表达谱差异分析、生物信息学分析和基因克隆等途径获得候选基因；(2)对候选基因进行功能评价(identificationoffunction，可在基因组、转录、蛋白质组和代谢产物等水平进行)；(3)基因功能确证(validationoffunction);(4)决定开发战略。获得候选基因的研究路线之一是通过正常和疾病组织的表达谱差异分析(expressionprofilingofnormalanddiseasedtissues)获得疾病的相关基因，进一步进行基因功能的筛选研究。该筛选策略与疾病过程密切相关，较多地应用于新药及治疗靶点的发现。确定候选功能基因获得候选基因的另一研究路线是通过生物信息学分析(bioinformaticanalysis)预测、选定基因序列、克隆获得候选基因，进一步进行基因功能的筛选研究。该研究策略筛选范围广，多用于新基因的功能探索研究。用于生物信息学分析的数据资料，主要来源于DNA芯片技术和其他相关技术测定的基因表达信息。通过与已知基因或蛋白质序列的分析、比较可以确定候选研究基因序列长度,提供该未知基因产物信号转导通路、细胞结构蛋白类型和细胞定位等预测信息。然而由于人类基因组中约1/3的基因序列与其他基因无同源性，因此这些基因的功能不易进行直接预测。另一方面，蛋白质的功能表现还与其所处的分子环境有关，一种蛋白质实际上与相邻蛋白质形成了功能网络(functionalnetworks)。因此，生物信息学中的功能网络数据库分析，对于了解复杂信号通路及与其他基因产物的关系，可能会提供有价值的参考信息。除上述研究策略外,其他途径的功能基因研究也在进行，如直接从正常或疾病组织中克隆单一未知基因，进行功能研究。EST技术及其在基因全长cDNA克隆上的应用策略摘要：随着人类基因组计划的顺利进行，EST技术被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域。利用人类基因组研究不断产生的数据，从ESTs即cDNA的部分序列入手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA文库等繁锁实验室工作。本文从原理、应用及其在科学研究上产生的影响等方面对EST技术进行了概述。表达序列标签（expressedsequencetags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。这一概念首次由Adams等于1991年提出。近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。文本将就EST技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。1、 ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。hMSH5基因是从酿酒酵母菌MSH5存在30%的一致性，它与hMSH4特异性相互作用，在减数分裂和精子发生过程中发挥一定的作用。由此可见，应用EST技术，可以跳过生物分类学的界限，从生物模型的已识别基因迅速克隆出人和小鼠基因组相应的更复杂的未知基因。生物间在核苷酸水平上的进货差异阻碍了传统意义上的杂交或以PCR为基础的基因克隆策略，即使是亲缘关系很接近的生物也不例外，如C.elegans和C.briggsae，它们仅在2〜5千万年前分化形成。而通过计算机进行dbEST进行数据库筛选，其配制是电子杂交实验，提供了一条更为广泛的基因识别路线，这一路线允许基因组间存在差异，这使得基因识别与新基因克隆策略发生革命性变化，同时它也提供了一个足够大小和复杂的基因数据库，目前，ESTs数量正以平均每月10万条的速度递增。2、 ESTs和物理图谱构建ESTs在多种以基因为基础的人和植物基因组物理图谱构建中扮演着重要角色。在这一应用中，从ESTs发展起来的PCR或杂交分析可用来识别YACs、BACs或其他含有大片段插入克隆类型的载体，它们是构建基因组物理图谱的基础，将EST与基因组物理图谱相比较即可辨认出含有剩余基因序列的基因组区间，包括调控基因表达的DNA控制元件，对这些元件进行分析就有可能获得对基因功能的详细了解。物理图谱与遗传图谱间的相互参考，形成一个用途更广泛的综合资源，获得这张综合图谱后，研究人员就可以孟德尔遗传特征为基础，将相关基因定位在基因组区间上，并且通过查询以ESTs为基础的苈图谱，即可获得这一区间上所有基因的名单。该综合资源用途的大小取决于EST数据库中拥有的基因数目。目前人和小鼠EST的不断扩充使其应用更加广泛和便捷。3、 ESTs和基因组序列注释EST数据库并非完美无瑕，因为ESTs不能被剪切为单列序列位点识读，故精确度只能达到97%，另外，ESTS受制于表达倾向(expressionbias)，因为产生ESTs的cDNA是组织中丰富的mRNA以一定比例反转录而成，因此，表达水平很低的EST数据库中找到，而表达量高的基因在EST数据库中却过量存在。虽然可在起始mRNA或由它合成双链cDNA时进行富集，减小cDNA文库，但cDNA文库中仍存在大量高丰度的cDNA克隆。因此，一个理想的cDNA文库必须去除或尽量消除多科信息克隆的影响，这就涉及到cDNA文库的前加工技术；均等化(normalization)，减少与丰富编码基因相关的cDNA数目；消减杂交(subtractivehybridization)，应用序列标记cDNA识别并去除文库中多余的克降，这些技术的发展，使基因识别更依赖于EST技术，甚至可通过该技术获得精确的基因组DNA序列，在华盛顿大学基因组测序中心和Sanger中心的联合攻关下，C.elegans基因组10亿个碱基对的测序工作基本完成。因此ESTs是一系列基因寻找工具中不可缺少后部分，而这些工具都是基因组序列为基础的。EST技术关于基因组DNA序列的其他应用还包括对基因内含子、外是子排列的精确预测，选择性接合事件的识别，反常基因组排列结构的识别等。4、ESTs与“电子”基因克隆利用计算机来协助克隆基因，称为“电子"基因克隆(sillconcloning)，是与定位克隆、定位候选克隆策略并列的方法之一，即采用生物信息学的方法延伸EST序列，以获得基因部分乃至全长的cDNA序列。EST数据库的迅速扩张，已经并将继续导致识别与克隆新基因策略发生革命性变化。4.1EST序列的获取利用计算机来协助克隆的第一步是必须获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有途径是寻找同源序列，标准：长度＞100bp，同源性50%以上、85%以下。可通过数个万维网界而使用BLAST检索程度实现，其中最常用的如NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的eneBank、意大利Tigem的ESTmachine(包括EST提取者和EST组装机器)、THC(TentativeHumanConsensusSequences)数据库、ESTBlast检索程序 通过英国人类基因组作图项目资源中心(HumanGenomeMappingProjectResourceCenter，HGMP—RC)服务器上访问。然后将检出序列组装为重叠群contig)，以此重叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠样系列，重复以上过程，直到没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，有时可获得全长的基因编码序列。获得这些EST序列数据后，再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测，假如凤有精确匹配基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。基因分析的结果大致有三种：第一是已知基因，是研究对象为人类已鉴定和了解的基因；第二是以前未经鉴定的新基因；第三是未知基因，这部分基因之间无同种或异种基因的匹配。新基因和未知基因将进一步用于生物学研究。4.2基因的电子定位基因的电子定位采用NCBI的电子PCR程序进行检索，寻找EST序列上是否存在序列标签位点(sequencetaggedsites,STS)，STS作为基因组中的单拷贝序列，是新一代的遗传标记系统，其数目多，覆盖密度较大，达到平均每1kb一个STS或更密集。将寻找到的STS与相应的染色体相比较，即可将此序列定位在该染色体上。4.3IMAGE克隆的索取许多ESTs所对应的cDNA克隆可通过基因组及其表达的整合分子分析(intergratedmolecularanalysisofgenomesandtheirexpression,IMAGE)协定免疫索取，这与电子基因克隆相辅相成，IMAGE协定由美国LLNL国家实验室主持，宗旨是共享排列好的cDNA文库中的克隆重，大规模的EST测序项目如Merk&Cow公司投资的人类ESTs项目等都加入了IMAGE协定。当研究者通过另外的途径得到基因的部分序列，并通过同源性检索后发现该片段与加入IMAGE协定的EST序列高度同源时，便可免费索取其原始克隆，可通过美国的ATCC组织(AmericanTypeCultureCollection)索取，从而避免或减轻筛选全长基因的麻烦，以集中精力进行基因的功能研究。5、结论人类基因组计划已进入后基因组时代，基因组学的研究从结构基因组学过渡到功能基因组学，利用结构基因组学的同存数据，充分发挥EST技术的优势，将为大规模进行基因识别、克隆和表达分析提供空前的动力，为生物论处学功能的发挥提供广阔的空间。传统mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)和第二代差异显示系统2006-12-1621:20真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的分化、凋亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约有30000个不同的基因，但在生物体内任意细胞中只有10%的基因得以表达，而这些基因的表达是按事件和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。其包括新出现的基因表达与表达量有差异的基因表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。由于基因差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。研究基因差异表达的主要技术有差别杂交(筛选)(differentialhybridization)、扣除(消减)杂交(subtractivehybridizationofcDNA，SHD)、mRNA差异显示(mRNAdifferentialdisplay，DD)、抑制消减杂交法(suppressionsubtractivehybridization，SSH)、代表性差异分析(representialdisplayanalysis，RDA)、交互扣除RNA差别显示技术(reciprocalsubtractiondifferentialRNAdisplay)以及基因表达系列(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)分析和电子消减(electronicsubtraction)和DNA微列阵分析(DNAmicroarray)等。本文来自这里我们重点介绍传统mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)和第二代差异显示系统：限制性酶切片段差异显示(RFDD-PCR)本文来自传统mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾(polyA)结构，因此可用含oligo(dT)的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人LiangP和PardeeA根据PolyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3'-锚定引物，其通式为5'-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5'端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。原理见下图：本文来自虽然mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）具有很多优点:1）速度快，较易操作;2）由于PCR扩增技术的应用，使得低丰度mRNA的鉴定成为可能，且灵敏度高;3）可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。但在实际操作中仍存在一些问题，主要表现在：1） 出现差别条带太多,假阳性率高达70%左右，重复性差，且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性；2） 在有差异的显示片段中难以知道哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因3） 得到的有差异的扩增条带短，一般在110〜450bp之间；4） 以poly（A）为引物的PCR扩增只适合真核生物。所以差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。第二代差异显示系统:限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR）就是一个很有效的改进。RFDD-PCR不是直接扩增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段两边加上特殊接头进行扩增。正是RFDD-PCR系统使用了一系列特殊接头和引物，特异性PCR引物的使用和下游的PCR反应使RFDD-PCR分析具有高度的重复性，解决了第一代差别显示系统的重复性问题；因为RFDD-PCR技术不使用以poly（A）为引物的PCR扩增，因而该系统对原核和真核系统皆适用；在第一代的差异显示系统中，下游引物特异性结合poly（A）尾，因此与3'端未翻译区域相对应的差异表达序列大部分被鉴别出，而RFDD-PCR采用优先切割翻译序列的限制性内切酶（如TaqI），因此可以优先展示编码区，更加适合于下游功能分析；使用RFDD-PCR或得差异显示基因后，与disployFit网络相连后，可以确定哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因，对下一步研究有很好的知道意义。总之，RFDD-PCR中高度严谨的PCR可以产生结果一致的基因表达图谱，重点放大和展示编码区，对原核及真核RNA都有用，大大消除假阳性。原理见下图生物学习之家基因打靶目的基因定位缺失点突变有好多啊！如果序列指导的话，设计针对未知基因的SiRNA，进行转染或转导，观察表型，也是好办法。要鉴定未知功能的基因可以用1突变法：将该基因敲除，看缺失什么功能，可以认为与这个功能相关，然后进行测序，与基因库NCBI进行比对，很可能与某些已经鉴定出功能的基因相似度高，进一步确定其功能。基因分离克隆的方法1基因芯片技术分离目的基因生物芯片是高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子的微列阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核算类物质，主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点阵两种。分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）基因。目前是通过①比较不同物种之间，或同一物种不同个体之间；或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异表达（基因表达平行分析）来实现的。采用基因芯片技术进行基因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mRNA的种类及丰度，与传统的差异显示相比具有样品用量小，自动化程度高，被检测目标DNA密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针从cDNA或EST微列阵中筛选分离目的基因。目前有DNA芯片、cDNA芯片两种。其基本步骤包括：基因芯片的制备、靶样品制备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。2基因文库技术分离目的基因基因文库指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体的形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑，或成活细胞）即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。其类型很多，如可分为基因组文库与cDNA文库、克隆文库与表达文库，按载体分有智力文库、噬菌体文库、黏粒载体文库、人工染色体文库等。基因文库构建后，从文库中筛选基因的方法主要有以下几种：核算杂交法、免疫学检测法、DNA同胞选择法、PCR筛选法等。基因文库的构建是目前基因工程的核心工作，也是分离目的进的常用方法之一。3功能蛋白组分离目的基因蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如：应用PCR进行分离目的基因：通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设计简并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全长；应用核算杂交筛选法分离目的基因：即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库；免疫雪筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。PCR技术在基因克隆中的应用PCR技术已经渗透到生物学的各个领域，在分子克隆和获得cDNA全长方面起着重要的作用。利用PCR技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mRNA差别显示（DDRT-PCR）可鉴定和分离出所需的目的基因；通过RT-PCR克隆到目的基因的cDNA区域进行cDNA文库的构建，通过锚定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。现在可用于基因分离和克隆的PCR方法主要有:RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小节），用于DNA序列克隆的Panhankle-PCR、Cassette-PCR以及减法cDNA文库的PCR法构建等°Panhankle-PCR、Cassette-PCR为基因组已知DNA相临未知序列的克隆奠定了良好的基础。mRNA差别显示技术分离差别表达基因mRNA差异显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速行之有效的方法之一。它是将mRNA反转录与PCR技术结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。它利用5’锚定引物oligo（dT）12MN和3’端随机引物对总mRNA进行PCR扩增，以期得到差异表达的条带。并对其差异显示的条带进行回收、克隆。6插入突变分离克隆目的基因获得突变体进行未知基因的克隆是常用的方法之一。这里举「DNA标签法和转座子诱变分离克隆目的基因的例子J-DNA标签法是将「DNA在任何感兴趣的基因处产生插入性突变，获得分析该基因功能的对照突变体。它将「DNA左右边界之间携带的外源报告基因片段作为一个选择性的遗传标记，因为插入的序列是已知的，因而对获得的转基因重组突变体就可以通过各种克隆和PCR策略加以研究。倘若将35S强启动子在T-DNA整合到宿主基因组后，整合到内原基因的上游，则可以产生异常增加或表达的时空特异性改变而破坏基因的表达的效果。有获得性突变和功能丧失性突变等。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系