免疫电镜专题知识讲座

免疫电镜专题知识讲座免疫电镜专题知识讲座第1页细菌，冰冻超薄切片，免疫标识腺苷酸环化酶，醋酸铀染色免疫电镜专题知识讲座第2页免疫电镜专题知识讲座第3页双标识菌毛上两种抗原，胶体金5nm,20nm免疫电镜专题知识讲座第4页免疫电镜要处理两个问题免疫电镜标本结构保留与抗原活性保留问题——二者经常矛盾在电镜下显示抗体适当标识物免疫电镜专题知识讲座第5页ξ1低温包埋超薄切片法制备免疫电镜标本1取材与固定

[目标]将所取样本尽可能固定在生活状态下，并保留样本抗原活性免疫电镜专题知识讲座第6页固定剂好不用锇酸不用或少用GA常见好FA抗原活性保留结构保留免疫电镜专题知识讲座第7页固定液4%FA(in0.1MPB)或4%FA+0.01~0.5%GA(in0.1MPB)免疫光镜预试验免疫电镜专题知识讲座第8页取材FA+GA固定液中4°C2~3h(中间1-2h可取出修块)封闭游离醛基（0.5MNH4Clin0.1MPB）4°C2h冲洗（0.18M蔗糖in0.1MPB）4°C2h或过夜中间换液2~3次*常规电镜标本可在冲洗液中存放1~2周，但免疫电镜标本不行，因为GA浓度很低微细结构改变大免疫电镜专题知识讲座第9页2脱水30%50%70%90%100%100%30m60m60m60m60m60m0°C冰水中加些盐-20°C低温冰箱-20~-40°C-20~-40°C-20~-40°C-20~-40°C[目标]去除样品中水，为包埋剂（水溶性）均匀浸透做准备脱水剂：乙醇，甲醇，异丙醇，乙醚，或丙酮（梯度脱水）免疫电镜专题知识讲座第10页脱水剂反抗元灭活作用随温度降低，但不能低到脱水剂结冰温度，所以应选择结冰温度低脱水剂预先冷却好全部用具免疫电镜专题知识讲座第11页3浸透与包埋[目标]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块免疫电镜专题知识讲座第12页包埋剂（几类物质混合物）羟丙基甲基丙烯酸酯（基础成份）乙二醇丙烯酸酯（交连固化剂）苯甲酸烷基乙醚（激活剂）LowicrylK4M(德国)LRWhite(英国)低温（-20~-40°C),紫外光照射下,自由基链式反应免疫电镜专题知识讲座第13页常规与免疫电镜包埋剂比较化学活性亲水性固化条件免疫电镜专题知识讲座第14页称量要准确，尤其量少胶拌时防止产生气泡（O2自由基聚合阻聚剂）使用无色透明胶囊（无色明胶或聚酯胶囊）包埋剂加满加盖用具全部预先冷却注意事项免疫电镜专题知识讲座第15页免疫电镜专题知识讲座第16页紫外照射聚合箱30~40cm紫外灯：波长360-365nm，N=12W-20~-40°C,24h,RT2-3d保留：干燥器（-20°C）可保留很长时间，取出时连同干燥器一同移至室温下，到达室温后再拿出免疫电镜专题知识讲座第17页4切片亲水性包埋剂切片与非亲水性包埋剂切片技术要领上有所不一样切片存放免疫电镜专题知识讲座第18页5免疫标识（略）免疫电镜专题知识讲座第19页6免疫标识后染色1.8%醋酸铀+0.2%甲基纤维素,RT,5m*不宜长时间冲洗（控制在5~10s），易脱色*任何一步都不能让载网干免疫电镜专题知识讲座第20页ξ2冰冻超薄切片法制备免疫电镜标本[特点]：简便，快，抗原活性保留好结构保留相对差，价格贵免疫电镜专题知识讲座第21页1取材与固定[固定目标]将各种组分尽可能固定在生活状态下，醛固定后蔗糖可渗透细胞FA(2~4%)+GA(0.01~0.5%)固定液中4°C2~3h(中间1-2h可取出修块)冲洗（0.18M蔗糖in0.1MPB）4°C2h或过夜，中间换液2~3次免疫电镜专题知识讲座第22页*固定时间越长，结构保留越好，抗原活性保留越差*对于可溶性物质（细胞溶质，分泌蛋白）需加GA以防止免疫反应过程中可溶性物质被抽提*对于膜或细胞骨架上物质而言，可溶性物质被抽提有利于膜或细胞骨架上物质接触免疫标识物免疫电镜专题知识讲座第23页2冷冻保护将标本块转移到蔗糖（2.3Min0.1MPB）溶液中，不少于30m免疫电镜专题知识讲座第24页3冷冻将标本块固定到样品架上，并一同在液氮中冷冻，然后将样品架快速转移到冷冻切片室中（-90~-110°C）免疫电镜专题知识讲座第25页4冰冻超薄切片在冰冻超薄切片机上进行*玻璃刀，钻石刀免疫电镜专题知识讲座第26页粗0.2mm不锈钢丝，园环直径~2mm蔗糖2.3Min0.1MPB

免疫电镜专题知识讲座第27页0.5μm,半薄切片相差显微镜50~100nm,超薄切片免疫电镜专题知识讲座第28页2%明胶(in0.1MPB)吸走蔗糖,降低背景等候免疫标识（存几个小时）切片存放明胶湿室免疫电镜专题知识讲座第29页免疫标识过程中，切片面浸湿，载网后面干燥载网浮在液滴上5免疫标识免疫电镜专题知识讲座第30页6免疫标识后染色染色液：4%醋酸铀+0.3M草酸（与醋酸铀等体积），用5%NH4OH调pH至7~7.5RT,5m免疫电镜专题知识讲座第31页7甲基纤维素包埋[目标]:防治干燥时产生皱缩2%甲基纤维素水溶液+2~4%醋酸铀（使醋酸铀最终浓度为0.1~0.4%）10m用不锈钢环捞出，滤纸吸水，干燥免疫电镜专题知识讲座第32页所形成甲基纤维素最终厚度与结构保留和图像反差关系亲密，干涉色呈金色，蓝色适宜厚，结构保留好，牺牲图像反差薄，图像反差好，留下干燥带来违迹厚度取决于移走甲基纤维素溶液量免疫电镜专题知识讲座第33页ξ3

电镜下显示抗体标识物—胶体金

免疫电镜专题知识讲座第34页热力学稳定热力学稳定热力学不稳定溶液（均相）沉淀（异相）溶胶（异相）1胶体（金）概念及性质免疫电镜专题知识讲座第35页溶胶主要特征：微小颗粒，颗粒越大越不稳定胶体金：1~100nm(<80nm红，80nm兰)制备：工业试验室HAuCl4+（单宁酸+柠檬酸钠）

Au可制备各种设定尺寸胶体金，颗粒均匀当代免疫化学标识技术，李成文免疫电镜专题知识讲座第36页胶体金优点结合原理为物理吸附重金属，图像反差好颗粒均匀，圆球形状，易于识别做成不一样大小尺寸，可进行双标识可同时用于免疫透镜，免疫扫描电镜免疫电镜专题知识讲座第37页胶体性质吸附离子而带电吸附大分子物质（物理）胶体沉聚（在胶体金中加入一定量电解质如NaCl,马上能够看到胶体金沉聚现象-由红色变成蓝色，放置一段时间或超速离心后在试管底部得到蓝色沉淀）胶体保护（在胶体金中加入一定量亲水大分子可使溶胶变得稳定，再加NaCl时不再出现沉聚现象）免疫电镜专题知识讲座第38页2胶体金-抗体复合物制备抗体蛋白不含或只含极少电解质IgG(1mg/ml)/四硼酸钠（2mMpH=9）4°C，20h,中间换液3~4次?免疫电镜专题知识讲座第39页最适pH：在靠近或略高于抗体等电点时复合物最稳定（高0.1~0.2pH）查抗体等电点IgG，最适pH=9.0~9.2PA,最适pH=5.9~6.2普通抗体pH在透析时调好胶体金pH用稀酸碱调（0.1MHCl,0.2MKCO3）*pH测定：重金属会阻塞电极，用pH纸或先在胶体金中加入2~3滴1%乙二醇（Mw20,000）后在测免疫电镜专题知识讲座第40页最适蛋白量：12345678水0ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml抗体0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml抗体浓度11/21/41/81/161/321/641/128胶体金0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5mlNaCl0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml免疫电镜专题知识讲座第41页最小蛋白量：找到胶体金颜色（红）刚开始改变（紫）试管，其前一管为最小蛋白量最适蛋白量：（１＋１０％）最小蛋白量？＊分子量小抗体应事先与非特异蛋白（如ＢSA）偶联后才能吸附到胶体金表面免疫电镜专题知识讲座第42页IgG-胶体金复合物制备将IgG溶于双蒸水内，浓度1mg/ml对2mM/四硼酸钠缓冲液（pH=9）透析，4°C，20h,中间换液3~4次离心，100,000g，4°C，1h，取上清调胶体金pH=9确定IgG与胶体金结合最适蛋白量按最适蛋白量混合IgG与胶体金，再加10%BSA1ml,轻轻混匀离心，4°C，45m，离心力大小由胶体金尺寸大小决定（15nm,60,000g，5nm,125,000g弃上清，将沉淀溶于1ml20mMTris缓冲液中（pH=8.2，内含1%BSA）免疫电镜专题知识讲座第43页ξ4免疫电镜试验设计包埋前法：先免疫标识，后制备超薄切片（适合用于抗原暴露在外情况，如膜外周蛋白）,超薄切片可按常规电镜标本制备技术进行包埋后法：先制备超薄切片，后免疫标识（适合用于细胞内抗原)，超薄切片技术需按免疫电镜标本制备技术进行免疫电镜专题知识讲座第44页亲和标识：抗原——抗体激素——受体糖基——植物凝集素免疫标识：一抗标识法，二抗标识法，

PA法，PG法，其它分子桥技术（如生物素与抗生素蛋白）免疫电镜专题知识讲座第45页包埋后法免疫标识程序[0.02M甘氨酸（in0.1MPB），10m(3*3)0.1MPB(含1%BSA),RT5m一抗[in0.1MPB(含1%BSA),],RT,1-2h或4°C过夜漂洗，0.1MPB，10m(3*3)二抗-胶体金，RT,1-2h漂洗，0.1MPB，10m(3*3)漂洗，ddH2