蛋白质的提取与粗分离

蛋白质提取与粗分级张明生物技术31002班2013年11月18日第一节蛋白质分离纯化概述蛋白质主要有20种氨基酸以肽键项链，由于氨基酸的种类含量几排列顺序不同形成了百亿种以上的蛋白质分离纯化蛋白质的目的是提高蛋白质的纯度蛋白质分离纯化与鉴定一般包含六个步骤蛋白质分离主要步骤选择实验材料实验材料的预处理蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定选择易获取、含量高、成本低的材料根据实验材料的特点选取合适的方法采用特定的缓冲液溶解材料，提取采用简单的技术手段初步分离蛋白质采用多种技术手段获得高纯度的蛋白质对蛋白质的分子质量、等电点等进行测定实验材料的选择要求：目标材料含蛋白质含量高杂质少容易获得成本低举例：植物的不同器官（根、茎、叶）、不同组织等预处理液体材料：过滤、离心等固体材料：洗涤、材料破碎等除杂第二节蛋白质的提取除少数蛋白质难溶解在普通溶液外，大多数蛋白质都能能溶解于水、稀盐溶液、稀酸溶液或有机溶剂中，因此采用相应的溶液即可把目标蛋白质提取出来提取蛋白质需要选择不同的缓冲液，这些缓冲液通常都含有九种成分蛋白质提取缓冲液的成分成分常用作用控制溶液PH的缓冲对Na2HPO3/NaH2PO3等维持蛋白质的结构与功能，提高溶解度控制离子强度的无机盐一定浓度的NaCl/KCl维持蛋白质的结构和功能控制氧化还原状态的还原剂ß-硫基乙醇、DDT还原作用蛋白酶抑制剂丝氨酸蛋白酶等，如表7-2抑制目标蛋白的降解蛋白质提取缓冲液的成分成分常用作用金属离子螯合剂EDTA、EGTA等消除某些金属离子对目标蛋白的影响标准牛血清白蛋白提高蛋白质浓度，利于其稳定去污剂曲拉通X-100，Tween-20，SDS等提取膜蛋白水和防腐剂避免杂菌污染甘油利于蛋白质结构和活性的保持第三节蛋白质粗分级使用蛋白质提取液提取实验材料后，获得的蛋白质粗提液中，目标蛋白的浓度很低，这使得我们可以采用简单的方法浓缩目标蛋白，并可将粗提液初步分为几份，这些纯化方法就是蛋白质的初分级蛋白质的粗分级主要有以下七种:1.硫酸铵分级沉淀2.有机溶剂分级沉淀3.超速离心法4.等电点沉淀5.透析法6.超滤法7.结晶法1.硫酸铵分级沉淀蛋白质的盐溶与盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析.在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH4)2SO4、NH4Cl等。中性盐对球状蛋白的溶解度有显著的影响：盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。盐析：高浓度的中性盐，如饱和(NH4)2SO4使蛋白质溶解度下降，从溶液中沉淀析出。盐析法在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等，其中以硫酸铵最为常用。因为硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小(在25℃时，溶解度为767g／L；0℃时，溶解度为697g／L)、不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其他中性盐进行盐析。

硫酸铵沉淀蛋白质主要与盐浓度有关，硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线性体积变化。

蛋白质溶液加入硫酸铵静止沉淀离心或过滤收集沉淀操作流程：蛋白质的盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度盐析盐溶影响盐析的因素温度pH值蛋白质浓度2.有机溶剂分级沉淀与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分离蛋白质。有机溶剂冷却到-40℃至-60℃在不断地搅拌下逐滴加入有机溶剂以防局部浓度过高有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一使水溶液的介电常数降低。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。3.超速离心法蛋白质在离心场中沉降时:Fc(离心力)=

mpω2x（离心加速度）Fb(浮力)=Vpρω2χ=mpυρω2xFf(摩擦力)=fν=

f(dx/dt)通过测定沉降界面的移动速度测定Mr.dx/dt为常数

Fc-Fb=Ff(dχ/dt)mp（1-υρ）