生物芯片原理

生物芯片原理

principleofbiochip

医学院病毒所2021/5/91本章提纲生物芯片简介生物芯片的分类基因芯片基本原理、流程与应用蛋白质芯片及应用2021/5/92第一节生物芯片简介

一、什么是生物芯片

生物芯片主要指通过平面微细加工技术，在固体芯片等载体上的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测2021/5/93芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个生物分子，能快速准确地检测细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，并获取样品中的有关信息，其效率是传统检测方法的成百上千倍。2021/5/94生物芯片分析过程试样处理点阵固定反应或杂交芯片制作标记洗涤检测扫描光刻合成微量点样喷墨纯化、标记光化学检测电化学检测计算处理2021/5/95

基因芯片的最大优点在于其高通量。传统方法检测众多基因要经历多次实验而且自动化程度低，因而每次实验之间是存在系统误差的。基因芯片可以克服这个缺点，众多基因的探针的标记、杂交等过程是在一次实验过程中完成的，而且自动化程度高，数据客观可靠2021/5/961996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并制作出相应的芯片系统。此外，美国的Hyseq公司、Aurora公司、Nanogen公司、Incyte公司等也在积极开展DNA芯片研究工作。近二年，摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资加入生物芯片的研究开发。

2021/5/97我国是从一九九七年开始对生物芯片研究。

中国医药生物技术协会生物芯片分会2006年在北京成立。中国在北京、上海、陕西、天津、南京建立了五大生物芯片研发和产业化基地。我国生物芯片产业尚未形成统一的技术标准，不规范。在产品认证认可方面也存在与国际惯例不接轨的情况。2021/5/98生物芯片技术是20世纪90年代以来，影响最为深远的重大科技进展。它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。

2021/5/99发展趋势

缩微芯片实验室生物芯片研究领域的一个热点，它是将传统的生物化学样品制备、生化反应、检测三个步骤集于一体，缩小构成芯片上的实验室系统2021/5/910第二节生物芯片的分类2021/5/911一般分类2021/5/912

信息生物芯片和功能生物芯片2021/5/913第三节基因芯片的基本原理与流程2021/5/914

基因芯片技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及检测等研究的技术。2021/5/915基因芯片发展历史SouthernandNorthernBlotDotBlotMacroarrayMacroarray2021/5/916RNADNA1DNA2ProbeSouthernhybridizationNorthernhybridizationHybridizationofNucleicAcids2021/5/917AminoacidsequenceGLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-----GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC---NucleicacidsequenceSynthesizingoligonucleotidePROBE

GGGGACGAGTCCTCCGTTCTThenucleicacidsequenceisDeducedfromaminoacidsequenceChemicalsynthesisPreparationofTraditionalNucleicAcidProbe2021/5/918基因芯片分类按芯片制备方法分类

原位合成芯片（syntheticgenechip）

DNA微阵列芯片（DNAmicroarray）按探针分类

寡核苷酸阵列

DNA阵列基因芯片

cDNA芯片

RNA芯片2021/5/919TypesofDNAChips2021/5/920生物芯片的原理生物芯片利用空间位置固定事先已知的核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物分子芯片技术对固定相分子的要求较高，要求生物分子固定在芯片基质上之后仍要保持生物活性的稳定。在分子杂交反应和洗片等处理过程中能稳定结合所亲和的分子，防止其在杂交洗涤过程中被冲洗掉，保证检测信息的准确可靠。2021/5/921制作芯片片基的材料首先必须有很好的光学性质，能利用光进行透射和反射的检测芯片表面具有可以进行化学反应的活性基团，方便生物分子的偶联而固定芯片表面的活性化学基团有足够的吸附能力，要能结合最佳容量的生物分子芯片要有很好的稳定性，具有一定的抗压能力，并且在生物分子杂交反应过程中要处于惰性状态，不会发生其他化学反应或其他物质吸附生物芯片要有很好的兼容性，可以广泛应用于生物学检测和研究芯片片基2021/5/922生物分子与芯片的结合生物芯片表面的活性基团形成特异亲和生物分子的位点，用来吸附和固定生物活性分子，例如多肽、核酸、酶、抗体或抗原等根据芯片基片表面的活性基团的类型，芯片可以分为氨基片、醛基片、环氧乙基片和N一羟基琥珀酰亚胺酯片根据不同的需要来选用芯片，如对大分子DNA的吸附要用氨基片，对寡聚核苷梭或小片段DNA要用醛基片2021/5/923a.

氨基片表面为氨基，直接与核酸分子的磷酸基团靠电荷作用相结合b.

醛基片表面的醛基直接与生物分子的氨基共价结合2021/5/924c.环氧已基片表面的环氧已基直接与生物分子的氨基共价结合；d.N-羟基琥珀酰亚胺酯片表面的N-羟基琥珀酰亚胺酯基直接与生物分子的氨基共价结合。2021/5/925DNAChipTechnologySolidsupport.glass,plastic,metal,silicon.MiniaturizedarrayofDNA(geneticmaterial)WorkonthebiochemicalprincipleofDNA/DNAhybridizationHybridizedprobes(DNAmolecules)arefluorescentlylabeled2021/5/926ComparisonofDNAChipTechnologies

SensitivityofDNAchipassaysProbeandtargetDNA/RNAComplexityChipsurface(autofluorescenceandnon-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationefficiency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise)Oligo-Chip cDNA-Chip GenomicChip8nor20n

<2,000n>50,000n

sequencingexpressionexpressiongenomicanalysis2021/5/927基因芯片的原理

依据双螺旋原理，核酸分子杂交技术，在靶标样品与探针之间进行选择性反应，将反应一方，探针固定在芯片上，另一方，荧光标记制备好的cDNA，分别标记绿色的Cy3和红色的Cy5通过流路或加至芯片上。2021/5/928基因芯片流程样品制备芯片制备杂交杂交信号检测数据分析2021/5/929EachspotcontainsknownDNAComplementaryDNAhybridizeSignalappearsBiochipBasedonHybridization2021/5/930实验流程2021/5/9312021/5/9322021/5/933影响杂交反应的因素

1探针浓度其浓度差异对信号有影响，浓度高信号强。2阳离子阳离子存在可提高异源杂交双链的生成速度。3温度ONA25~42C，cDNA55~70C

4序列组成芯片上一次产生上万个异源杂交反应，应选择最协调条件。5高灵敏度监测系统，阅读仪。2021/5/934

基因芯片检测原理

荧光扫描成像用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；而不完全杂交的分子热力学稳定性低，荧光信号弱；不杂交的无荧光。不同位点的信号被扫描后由计算机软件处理，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。

2021/5/935基因芯片数据分析

图像分析，Ratio值分析，基因聚类分析

图像分析激光扫描仪得到的扫描图像文件通过划格，确定杂交斑点的位置，然后经过过滤背景噪音，提取得到荧光信号强度值，最后以数据列表的形式输出。这一系列的工作都是依靠软件来完成，如Biodiscovery，Imagene7.0分析软件。2021/5/936

Ratio值分析

在常用的双色荧光芯片系统下，各杂交斑点的两色荧光cy3／cy5的比值又称R/G值。一般认为R／G值在0.5～2.0范围内的基因不存在显著表达差异，该范围之外则认为基因的表达出现显著改变。由于实验条件的不同，该域值范围会根据置信区间进行调整。处理后得到的信息可以根据需要以各种形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始匡像拼图等。将每个信号斑点的所有相关信息如位标、基因名称、克隆号、PCR结果、信号强度、Ratio值等自动关联并根据需要筛选数据。2021/5/937

聚类分析clusteringanalysis

从生物芯片的图像分析中可得到大量的数据，要从中提取所需要的信息就必须对这些数据的统计分析。通过建立各种数学模型，分析芯片图像数据的生物学意义。聚类分析是利用大量相关数据对事物进行分类处理，其方法为直接比较样本中各种特征数据，将特征相近的归为一类，差别较大的归为不同的类。2021/5/938四生物芯片的制作基本方法点样法和原位合成法原位合成法原位光刻合成压电打印法2021/5/939

点样法这一方法相对技术要求不高，是最常用的方法。点样法是将预先合成好的探针、PCR产物、蛋白或多肽、抗原或抗体等经纯化、定量分析后，通过由阵列复制器或阵列点样机准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或玻片等相应位置上，再进行固定处理，如紫外线交联固定。2021/5/940

点样的方式分接触式点样与非接触式点样两种。接触式点样是点样针直接与固相支持物表面接触，将生物分子样品留在固相支持物上。非接触式点样以压电原理将样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2500个探针；缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。2021/5/941原位合成法

原位合成法

该方法技术比较复杂，除了Affymetrix等少数实力雄厚的生物芯片公司可以用该技术外，其他的公司和实验室都是采用点样法制作芯片。原位合成方法有两种途径，一种是原位光刻合成，该技术是由Affymerix公司的Fodor实验室开发。该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的多肽或寡聚核苷酸阵列。2021/5/942

另一种原位合成是压电打印法，主要用于合成寡聚核苷酸探针，其原理与普通的彩色喷墨打印机相似，所用技术为常规的固相合成方法。根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置，冲洗、去保护、偶联等与一般的固相合成技术相同。

该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，不需要特殊制备的化学试剂，可以合成出长度为40～50个碱基的探针。2021/5/943一个实例基因芯片筛选宫颈癌相关基因的研究摘要本研究中采用细胞原癌、抑癌基因分类芯片对原发性宫颈癌标本进行分析，以期探讨宫颈癌基因组中存在的癌基因表达的变异，确定与宫颈癌相关的候选原癌或抑癌基因，为宫颈癌的诊断和治疗提供新的线索和依据。

2021/5/944实验结果1组织总RNA制备本实验中共收集到宫颈癌组织0.96g，正常对照宫颈组织0.56g，分别提取总RNA。两种宫颈组织的总RNA提取的质量见表1

表1总RNA提取结果样品类型编号总RNA量OD260OD280OD260/OD280荧光标记正常宫颈组织N706.8μg0.5920.2892.059Cy3

对照组宫颈癌组织C1200.0μg1.0150.4882.114Cy5

实验组2021/5/945

芯片扫描结果

Cy3

Cy52021/5/946宫颈组织/对照组织双色荧光标记芯片扫描叠加图

2021/5/947

图中X轴、Y轴分别以cy3荧光强度值(前景值－背景值)和cy5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号；数据点若为红色，则代表Y值与X值的比值在0.5至2.0之间，属非差异表达；数据点若为黄色，则代表Y值与X值的比值在0.5到2.0范围之外，表明所代表的基因存在表达差异。2021/5/9482021/5/949通过对基因芯片结果的分析，发现BLACP，bladdercancerrelatedprotein基因即膀胱癌相关蛋白基因的表达下调最为明显，提示BLACP基因与宫颈癌之间存在着联系。很可能是一个宫颈癌相关的候选抑癌基因。该基因在包括人在内的多种动物中已有发现。尚未发现与人类其它的基因有任何的同源性。鉴于此，在本实验中BLACP基因克隆到真核表达载体上，转染宫颈癌细胞系HeLa，发现它的确可以抑制HeLa细胞的生长及增殖。2021/5/950

GenomicchipScreenspecimenstodeterminegenecopynumberchangesEstablishcorrelationsbetweengenecopynumberchangesanddiseasebiologyDeterminetheinteractionofmultiplegenesontheinitiationandprogressionofdiseaseAcceleratedevelopmentofproductsforgenomicdiseasemanagementtoguidetherapeuticinterventionCombinedwithexpressionchips,givesfullunderstandingofdiseaseprocess2021/5/951三、芯片技术的应用1基因表达分析分析基因表达时空特征检测基因差异表达发现新基因大规模测序2021/5/952

DNA序列测定人类基因组计划鉴别和测定人类基因的DNA序列,杂交测序sequencingbyhybridization,SBH

建立在特定序列的DNA与特定长度的寡核苷酸集合的杂交的基础之上。未知DNA序列可以通过鉴定与靶DNA序列形成完整的双链体寡核苷酸的重叠区域来确定；65536个八核苷酸点阵可测定约200个核苷酸的序列；一百万个十二核苷酸点阵可测定约1000个碱基对。2021/5/9532基因型、基因突变和多态性分析

分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系3疾病的诊断与治疗遗传病相关基因的定位，产前筛查与诊断肿瘤诊断感染性疾病的诊断

基因突变检测与遗传病和肿瘤诊断的大量平行测定2021/5/9544.药物研究中的应用

新药开发发现药物的新功能

调查药物处理细胞后基因的表达情况对药物进行毒性评价

在基因水平上寻找药物靶标，毒性对基因的影响。2021/5/955其它病原体的检出肿瘤相关基因表达谱位点突变耐药基因检测疾病的分子分型

HLA分型2021/5/956基因芯片的缺点不能对待检测基因在组织中的精确定位进行判断。另外很多蛋白质功能不是主要依赖是否表达或表达量高低，而是依赖蛋白质磷酸化/去磷酸化等方式。在这种情况下，用核酸类生物芯片就没有什么意义，蛋白类芯片可能会有所作为。不能盲目崇拜高精尖端的技术和仪器设备。实事求是，定位明确，按规律办事。2021/5/957生物芯片的未来2021/5/958

您只需提供保存完好的组织或细胞标本，公司的芯片技术服务人员就可替您完成实验操作与数据分析，向您提供由您所选的任何一个芯片的实验结果，可以为您节省大量的时间与精力。客户样品RNA抽提——RNA质量检测——cDNA模板制备——实时定量PCR芯片——数据处理——提供实验报告2021/5/959细胞凋亡PCR芯片

细胞周期PCR芯片

血管生成PCR芯片

肿瘤转移PCR芯片

癌通路发现者PCR芯片

DNA损伤信号通路PCR芯片氧化应激与抗氧化PCR芯片

应激和毒性通路发现者PCR芯片

肿瘤药物耐受和代谢PCR芯片

细胞因子PCR芯片乳腺癌和雌激素受体信号通路PCR芯片

药物代谢PCR芯片

内皮细胞生物学功能研究PCR芯片

骨再生PCR芯片

干细胞PCR芯片

动脉粥样硬化PCR芯片

糖尿病PCR芯片

趋化因子与受体PCR芯片

2021/5/960生长因子PCR芯片

炎症细胞因子与受体PCR芯片

干扰素及其受体PCR芯片

Th1-Th2-Th3PCR芯片

Toll样蛋白受体信号转导PCR芯片

细胞外基质与粘连分子PCR芯片

神经营养素与受体PCR芯片

低氧信号通路PCR芯片

2021/5/961胰岛素信号通路PCR芯片JAK/STAT信号通路PCR芯片MAPK信号转导通路PCR芯片NF-kB信号通路PCR芯片一氧化氮PCR芯片Notch信号通路PCR芯片信号转导通路发现者PCR芯片TGFb/BMP信号通路PCR芯片TNF配体及受体PCR芯片Wnt信号通路PCR芯片管家PCR芯片2021/5/962第四节蛋白质芯片及应用2021/5/963蛋白质芯片是指以蛋白质分子作为配基，将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列，用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。又称为蛋白质阵列或蛋白质微阵列（proteinmicroarray）2021/5/964根据其固定生物分子的不同，可以分为受体配体检测芯片，抗原芯片，抗体芯片根据芯片载体的不同，分为普通玻璃载玻片，多孔凝胶覆盖芯片和微孔芯片3种主要形式。普遍应用的是玻璃片，另外也可以应用PVDF膜，聚丙烯酰氨凝胶，硝化纤维素膜，聚苯乙烯微珠，磁性微珠等2021/5/965蛋白质芯片的分类蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片2021/5/966与基因芯片的比较蛋白质是基因表达的最终产物,接近生命活动的物质层面探针蛋白特异性高、亲和力强,可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料，血样、尿样、细胞及组织等进行检测适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用2021/5/967蛋白质芯片技术的原理蛋白质芯片技术主要包括四个基本要点