目的基因的获得

种子生产与经营专业《作物育种技术》目的基因的获得教学目标一、目的基因的概念目的基因指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因。依据基因的功能，目的基因可分为功能基因（编码特定的功能性蛋白）和调控基因（编码转录因子和小RNA等基因表达调控因子）两大类。二、目的基因的获得途径（一）根据基因表达的产物即蛋白质进行基因克隆主要步骤如下：分离蛋白质氨基酸序列推导核苷酸序列人工合成功能鉴定利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。局限性：兼并密码子、效率低、未知基因及产物。二、目的基因的获得途径（二）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因1.有同源序列法根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员。氨基酸序列比较设计简并引物PCR扩增文库筛选/RACE二、目的基因的获得途径（二）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因2.表达序列标签（EST）法表达序列标签法是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过cDNA的途径获得。获得EST的途径:大规模cDNA文库测序各种mRNA水平的分析手段二、目的基因的获得途径（二）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因2.表达序列标签（EST）法mRNAcDNA反转录酶cDNA文库PCR差异显示抑制消减杂交…ESTRACE/文库筛选dbESTGenBank二、目的基因的获得途径（二）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因3.图位克隆法依据目的基因在染色体上的位置，通过分子标记、基因组文库筛选和鉴定最终克隆目的基因。二、目的基因的获得途径（二）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因4.转座子标签法转座子是染色体上一段可复制、移动的DNA片段。当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型；当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。目前应用最为广泛的转座子系统是Ac/Ds玉米转座子系统。二、目的基因的获得途径（二）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因4.转座子标签法插入突变体筛选突变DNA文库，PCR，RACE鉴定性状遗传分析转座子DNA探针基因部分DNA探针筛选野生型DNA文库，PCR，RACE完整目的基因互补实验二、目的基因的获得途径（二）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因5.差异显示法在生物个体发育不同阶段，或不同的组织与细胞中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式，叫做基因的差异表达。差异显示PCR（differentialdisplay-PCR,DD-PCR）是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。二、目的基因的获得途径（二）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因5.差异显示法12叶mRNA根mRNA反转录反转录PCR随机引物+3′锚定poly(t)引物PCRPAGE叶根二、目的基因的获得途径（二）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因6.电子克隆法利用计算机技术,依托现有的网络资源（EST数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等），采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列