高效液相色谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法分析天花粉蛋白胰酶肽图谱

高效液相色谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法分析天花粉蛋白胰酶肽图谱维普资讯////0>.研究论文生命科学仪器第卷/第期高效液相色谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法分析天花粉蛋白胰酶肽图谱喻志强,唐辰虹,施荣华,吴高,罗昭锋.中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家实验室,生命科学学院,合肥安徽.安徽医科大学老年医学教研室,合肥安徽摘要目的:建立了检测天花粉蛋,肽图谱方法。方法:采用反相高效液相色谱法和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱??法对天花粉蛋白的肽图谱进行了测定,比较了不同批次产品一级结构的一致性,并用??法进行了验证。结果:用?和??法检测天花粉蛋白胰酶裂解后的肽段,发现各批产品的一级结构具有一致性,此分析方法具有简单,灵敏度高,可靠等优点。结论:本法适应于天花粉蛋白药物的肽谱分析,同时也为分析修饰天花粉蛋白药物肽图谱提供了可以借鉴定手段。关键词反相高效液相色谱,天花粉蛋白,肽图谱,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速,有效地进行了的肽谱分离,这些尝试希前言望能对修饰的蛋白质药物鉴定提供可供借鉴方法。本方法也为检测蛋白药物提供了一种可供借鉴肽图谱分析是鉴定蛋白药物的重要手段。目前的手段。主要用于肽图谱分析的主要方法是法,法,质谱法等。现已有多种蛋白用法进行肽谱试验部分分析报道,包括人生长激素,人粒细胞集落刺激因子.仪器和试剂及修饰人生长刺激蛋白,引。肽图法已成为Ⅲ??德国公司,在蛋白质及多肽分析中最重要、最广泛的应用,型酸度计上海分析仪器厂无锡分厂;已用于重组蛋白质量控制、疾病诊断等诸多领域。天花粉蛋,是中药天花粉的型液相色谱,监测器;反有效成分,传统上用于早期引产,治疗葡萄胎?。同时卡目柱?.×公司。还是一种有前途的抗肿瘤药物,具有一糖天花粉蛋白来自安科生物工程股份;苷酶活性,在临床上对爱滋病治疗也具有令人鼓舞【氢基,?羟基肉桂酸为公司产品,的运用前景。最近在运用基因工程定点突变或化胰蛋白酶为公司商品,经过甲苯黄酰一一苯丙氨酸氯甲基酮预处理;三氟乙酸德国学修饰手段对蛋白共价修饰,如蛋白的聚公司;磷酸二氢钠;氢氧化钠;盐酸;乙腈乙二醇,修饰研究已引起国内外学者浓厚兴趣,因为聚乙二醇共价修饰蛋白均为国产分析纯试剂。质药物具有如下优点,可以消除蛋白质药物的抗原.溶液的配置性及免疫原性延长小分子多肽在体内的半衰期。但..色谱流动相流动相:取三氟乙酸于水中;流是由于修饰后蛋白质一般为较复杂的混合物,动相:取三氟乙酸于乙腈中,..使这是由于被修饰蛋白质上待连接的活性位点的活性用前均经.滤膜抽滤脱气。不同,空间位阻不同导致每个蛋白分子上连接的数和连接的位置不同,因此修饰后的蛋白..酶解样品经过纯化和修饰的特定位点及特定位点被修饰程度取冷冻干燥后的天花粉酶解粉末,溶解在的检测,才有可能成为安全有效的蛋白质药物。双蒸馏水中,溶液浓度为/。.方法本文以天花粉蛋白为模式蛋白,运用?..天花粉蛋白的胰蛋白酶酶切分离技术,同时结合??法,可维普资讯////.研究论文生命科学仪器第卷/第期方法】取天花粉蛋白,加人./含有个氨基酸,中含有个和尿素,在%沸水中加热,加入.双蒸水个,理论上应有个裂解位点,产生个肽段,和../,溶液,震荡,%酶解,但由于酶解不完善或在非,残基上切断,产生冷冻干燥。肽段数不一定与理论值相符。..?分离条件从肽谱图看,测定了约个肽段分子量,其中色谱条件:色谱柱为反相柱一Ⅱ有几个肽段为胰酶自降解肽段,还有几个肽段为酶.,柱温℃,流速./,检解不完全或非特异性降解产生,如:肽段,,,非特异性降解,分子量为.,.肽段测波长。二元洗脱梯度为:在内流动相由%到%。程序结束后,色谱柱用流动相清为胰酶自降解峰。经计算机数据库辅助分析,其中有洗.每次进样体积,样品浓度为,个肽段的与理论值个肽段相符,匹配度达重复次进样。.%,匹配情况见表。..??条件检测条件:激光器,激光波长;速电压;基质一氢基,?羟基肉桂酸用%乙腈溶液饱合;样品水溶液与基质混合后,滴于不锈钢靶上,空气中自然干燥后,推人离子源中测定。图上图表示酶解肽段?色谱图结果色谱条件:色谱柱为反相柱一¨.,柱温℃流速/,检测波长洗脱梯度:在内流动相由%上升%.?法分析的肽图谱从色谱图看,在上述色谱条件下,大约有个左右酶解肽段得到基线分离,酶解肽段分离是相当成功的,因为胰酶酶解后理论肽段叠星数目为,同时这也暗示;§酶解相当完全而且特异..引.和性也比较高。另外从三批酶解肽段的色谱图谱图谱没有给出,各批间的肽谱几乎一致,各峰数目和保留时间也大致相同。冕专.??法分:翌析肽图谱叠矗;酶解肽段的谱肽图,可见图仅测??.“部分,共测定几个肽段,各肽段的分子量较图胰酶酶切??肽图谱肽图谱图更直观。注:上面图实际上为同一肽谱图,其横坐标范围为?维普资讯////.研究论文生命科学仪器第卷/第期表胰蛋白酶酶切?结构之间的同一性,确认基因工程上游和下游处理过肽图谱计算机辅助分析结果程中是否发生差错、重组产物中是否存在转译后化学修饰及预期氨基酸的变异等,而且不同批次产品的肽图谱的比较可验证工艺过程的稳定性,因此肽图分析在基因工程产品质控中尤为重要.法已成为肽图分析的最常规手段之一,??法同样可进行肽图分析,质谱法一个突出优点是可进行混合物的分析,在一次测定中可给出混合物中所有物质准确的分子量,它与酶解或化学降解相结合是确认基因工程药物与天然组分一级结构一致性的好方法,具有快速、准确、结果直观的优点.本文以天花粉蛋白为模式蛋白,运用?分离技术,同时结合??法,快速,有效地进行了的肽谱分离,这些尝试希望能对修饰的蛋白质药物鉴定提供可供借鉴方法,此方法也为其它重组和修饰蛋白药物一级结构的分离提供了一种快速,简便的方法。参考文献,...,,:~,,,....,,:?,,,.....,,:?考虑到质谱测定时上样微量化,样品与基质混汪猷,金善伟.天花粉蛋白】.北京:科学出版社,:合不均一化因素,混合肽段中微量样品可能不能完张劲松,刘望夷.天花粉蛋白的作用机制一糖苷酶全检测出来,在本试验中,收集了?分离后型.生物化学和生物物理进展,:?;?.??各个组分,进行离线?测定,发现个肽?.段的测定分子量与理论分子量一致,匹配度达.,,.%,其中组分在测定酶解混合物质谱时没有找..到,而在混合肽段中能测定出来的肽段,均可在离线:.?中贝定出来,两者结果相差不是很大,说,,,.?明酶解程度和质谱检测的灵敏度都很高,结果??.可信度好。,,:?将测定的肽谱数据输入蛋白质数据库,如汪猷,顾梓伟,叶国杰.,苦瓜子胰蛋白酶抑制