实验四电泳技术及详解演示文稿

实验四电泳技术及详解演示文稿目前一页\总数四十五页\编于二十二点（优选）实验四电泳技术及目前二页\总数四十五页\编于二十二点+-1.许多生物分子带有电荷，在电场中可以发生移动。2.每种分子迁移率不同，一定时间内在电场中的迁移距离不同。在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。原理目前三页\总数四十五页\编于二十二点二、电泳迁移率设一带电粒子在电场中所受的力为F，则F=QE（Q为粒子所带电荷，E为电场强度）根据Stoke定律，一球形分子在溶液中运动所受的阻力f为：f=6πrηv（v为分子移动速度；r为分子半径；η为介质黏度）目前四页\总数四十五页\编于二十二点当分子达到动态平衡时，F=f即QE=6πrηv移项得v/E=Q/6πrηv/E:表示单位电场强度时粒子运动速度，称为迁移率，也称电泳速度，以表示。

因此上式也可表示为：=Q

/6πrη从上式可推知，带电粒子在电场中的移动与:粒子大小有关，颗粒愈小愈快粒子的电荷有关，电荷愈多愈快粒子的形状有关，愈接近球形愈快目前五页\总数四十五页\编于二十二点三、影响迁移率的因素1.电场强度（E）

电场强度是指每厘米的电位降。电泳速度与电场强度成正比。电场强度越高电泳速度越快。

根据电场强度大小，电泳可分为：常压电泳：2～10V/cm高压电泳：20～200V/cm2.溶液的pH值

pH值决定带电颗粒的解离程度，决定物质所带净电荷的多少。选择合适pH，使混合物中各成分所带电量差别较大。

pH>pI带负电pH<pI带正电目前六页\总数四十五页\编于二十二点3.溶液的离子强度

缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢一般在0.02-0.2mol/L。4.电渗现象

在电场中液体对固体支持物的相对移动。电泳介质多孔，且带有可解离的化学基团，吸附正离子或负离子，使溶液相对带电。应尽量避免选用有电渗作用的支持物。目前七页\总数四十五页\编于二十二点四、电泳的分类按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。目前八页\总数四十五页\编于二十二点根据支持介质物理形状不同（1）滤纸及其它纤维素薄膜电泳（2）凝胶电泳（3）粉末电泳（4）线丝电泳

根据支持介质的装置形式（1）平板式电泳

（2）垂直板式电泳（3）连续式电泳（4）圆盘电泳

根据pH连续性与否（1）连续pH电泳（2）非连续pH电泳

目前九页\总数四十五页\编于二十二点琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质目前十页\总数四十五页\编于二十二点五、琼脂糖凝胶电泳特点1.具有大量微孔

孔径大小取决于浓度：0.075%浓度孔径800nm0.16%浓度孔径500nm1%浓度孔径150nm2.具有较高的机械强度可以在1%或更低浓度下使用3.无毒，不需要催化剂4.具有热可逆性，低熔点琼脂糖回收样品容易5.胶凝温度34-43℃熔化温度75-90℃低熔点琼脂糖胶凝温度低于30℃(融化温度高于30℃)目前十一页\总数四十五页\编于二十二点电极缓冲液TAE:40mM/LTris-醋酸1mM/LEDTA5×:24.2克Tris5.7ml冰醋酸10ml0.5M/LEDTATBE:

45mM/LTris-硼酸1mM/LEDTA5×:54克Tris27.5克硼酸10ml0.5M/LEDTA目前十二页\总数四十五页\编于二十二点琼脂糖凝胶电泳优点：1.双重效应：电泳效应、分子筛效应。2.操作简单，电泳速度快，样品无需预处理。3.电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。4.凝胶透明且无紫外吸收，可在紫外灯下观看结果。5.易染色，易洗脱，便于定量。

琼脂糖凝胶电泳一般用于核酸的分离分析。目前十三页\总数四十五页\编于二十二点琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖浓度%线状DNA分子分离范围Kb0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2目前十四页\总数四十五页\编于二十二点目前十五页\总数四十五页\编于二十二点六、等点聚焦1.用两性电解质建立电场中连续线性pH梯度2.只适用于两性解离的物质电泳pH1018642pI—＋目前十六页\总数四十五页\编于二十二点目前十七页\总数四十五页\编于二十二点目前十八页\总数四十五页\编于二十二点七、双向电泳

(2-DE)目前十九页\总数四十五页\编于二十二点蛋白印迹(westernblotting)检测血清中的免疫球蛋白目前二十页\总数四十五页\编于二十二点一、概念

通过PAGE/SDS分离样品中不同的蛋白质组分，利用电转移法将电泳分离的蛋白质从凝胶转移至一种固相支持物，然后用免疫学原理来检测目的蛋白质。常用于检测样品中特异蛋白的存在、以及半定量分析。目前二十一页\总数四十五页\编于二十二点制备蛋白样品SDS转膜免疫学检测二、工作流程

封闭一抗杂交二抗杂交底物显色/发光目前二十二页\总数四十五页\编于二十二点1.蛋白样品的获得来源：组织、细胞、体液方法：可用各种蛋白裂解液目前二十三页\总数四十五页\编于二十二点聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）聚合交联成三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE）。PAGE灵敏度高（ug），分辨率高（几个bp）。

PAGE电泳体系中加入SDS--→SDSPAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及少量制备，还可测定分子量、等电点等。2.SDS目前二十四页\总数四十五页\编于二十二点2.1聚丙烯酰胺凝胶的优点(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g;(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径;(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。目前二十五页\总数四十五页\编于二十二点分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度(%)蛋白质1041～4×1044×104～1×1051～5×1055×10520～3015～2010～155～102～5核酸104104～105105～2×10615～205～102～2.6目前二十六页\总数四十五页\编于二十二点2.2聚丙烯酰胺凝胶的制备

Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在自由基存在时就会发生聚合反应形成凝胶。引发产生自由基的方法有化学和光聚合两种方法。1）化学聚合常用的催化剂系统有：

（1）过硫酸胺（AP）——TEMED(四甲基乙二胺)；（2）过硫酸胺——DMPN(二甲基氨基丙腈)；（3）过硫酸胺——三乙醇胺。2）光聚合由光敏物质核黄素代替过硫酸铵作催化剂。目前二十七页\总数四十五页\编于二十二点影响聚合反应的因素：（1）大气氧能淬灭自由基，抑制聚合。在进行化学聚合前，一般在胶液表面，覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。（2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。（4）过硫酸铵易潮解失效。目前二十八页\总数四十五页\编于二十二点2.3SDS分离蛋白的原理电泳体系由浓缩胶、分离胶及电极缓冲液组成。

①浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HCl。

②分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8Tris-HCl。③电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性→→样品浓缩的主要因素。

目前二十九页\总数四十五页\编于二十二点SDS分离蛋白的特点1)样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性；(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；(2)分子筛效应(3)电荷效应8.38.38.86.8目前三十页\总数四十五页\编于二十二点2.4十二烷基磺酸钠（SDS）的作用SDS：阴离子表面活性剂，能够使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质上（结合比为1.4gSDS/1g蛋白质）使各种蛋白质-SDS复合物都带有相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小。可以利用SDS测定蛋白质分子量。实验中同时加入巯基乙醇（强还原剂），使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，利于蛋白质和SDS定量结合。目前三十一页\总数四十五页\编于二十二点3.转膜实现蛋白从凝胶到膜的转移常用的固相支持物：NC膜,PVDF膜转膜方法：电转移法（湿法、半干法）转膜装置：夹心三明治结构(阴极碳极板、海绵、滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、海绵、阳极碳极板)，180mAX2hrs/100vX1hr转膜效果检测：①膜的检测：丽春红染膜；应用预染蛋白Marker②凝胶的检测：考马斯亮蓝染色转膜后的胶目前三十二页\总数四十五页\编于二十二点4.免疫学检测封闭：5%脱脂奶粉或BSA，封闭非特异结合位点。一抗孵育：一抗与封闭液以一定稀释度配比。二抗孵育：用与一抗种属相同的二抗进行孵育。检测：利用二抗上的标记物（AP/HRP）可以使底物显色或发光来检测蛋白。注意事项：①一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白质要经过预实验确定。②底物溶液要新鲜配制。③带手套操作，避免样品污染，也保护自己。目前三十三页\总数四十五页\编于二十二点SDS-目前三十四页\总数四十五页\编于二十二点三、仪器、原料和试剂试剂：10%SDS、凝胶贮存液（30%ACr-Bis）、分离胶缓冲液（1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液）、浓缩胶缓冲液（1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液）、10%过硫酸铵、TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、0.05%考马斯亮兰R250器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床原料：血清蛋白样品目前三十五页\总数四十五页\编于二十二点目前三十六页\总数四十五页\编于二十二点四、实验步骤1、安装夹心式垂直板电泳槽

：注意：安装前，胶条、玻璃板都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。2、配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。3、制备凝胶板（1）分离胶制备（10%分离胶，20ml/电泳槽）（2）浓缩胶的制备（5%浓缩胶，10ml/电泳槽）目前三十七页\总数四十五页\编于二十二点目前三十八页\总数四十五页\编于二十二点目前三十九页\总数四十五页\编于二十二点4、样品的处理及加样将血清样品