血红蛋白电泳的意义和判断

ADULTANDNEWBORNHemoglobinscreeningwithcapillarys2021/10/101目的血红蛋白结构和功能的回顾SebiaCAPILLARYS2/Minicap血红蛋白检测说明血红蛋白临床结果说明2021/10/102血红蛋白的结构血红蛋白分子是由4条多肽链(2对)和4个可以结合铁和氧气的血红素.Normalhemoglobins,contain

alpha,beta,delta,andgammaglobinchains.2021/10/103三维结构4亚单位

2alpha链2alphagenes3«

非

»alpha链:beta,delta,gamma1bgene,1dgene,2ggenes2021/10/104正常结果HbA:a2b2HbF:a2g2HbA2:a2d2

+-琼脂糖凝胶Hydrasys®(Sebia)碱性缓冲液成人新生儿2021/10/105血红蛋白遗传病类型(HEMOGLOBINOPATHIES)?血红蛋白疾病血红蛋白性质变化:血红蛋白分子病结构异常,一个或数个氨基酸变异或缺失,都将会导致血红蛋白分子的电性发生改变常见血红蛋白变异体b-globin:S–C–DPunjab–E…血红蛋白含量变化:地中海贫血合成或合成调控异常:bglobinbThalassemiasaglobinaThalassemias合并型:血红蛋白分子病Hemoglobinopathies/地贫Thalassemias2021/10/106血红蛋白遗传病遗传性疾病基因学图谱正常基因异常基因2021/10/107异常血红蛋白类型目前,已经证实的有超过1000种以上的变异体(a,b,gandd)大部分变异体出现频率较低,并且没有明显临床症状4种主要变异体(HbS,HbC,HbEandHbDPunjab)出现频率较高(特定人群)携带者会出现健康问题儿童可能在出生时即伴随有严重症状2021/10/108血红蛋白疾病的区域分布图Thalassemias2021/10/109

常见与地中海区域:意大利,西班牙,希腊,近东地区,非洲北部.

同样常见于东南亚:泰国,印度,越南,中国,印尼.

临床症状

*Beta地贫重症型-严重贫血(需要长期输血治疗) *Beta地贫中间型 *Beta地贫轻微型-无临床症状Beta地中海贫血

常见区域bo没有Beta链合成b+

合成能力下降2021/10/1010Alpha地中海贫血

临床症状:根据Alpha基因的表达状态,有4个不同程度的Alpha地贫症状 *1个基因表达沉默:静止型(非常难检测到,在出生会测到HbBart’s1-2%) *2个基因表达沉默:轻型alpha地贫,在出生会测到Bart’s2-10% *3个基因表达沉默:血红蛋白HbH病,出生时出现2-30%Bart’s,儿童-成人出现10-15%HbH *4个基因表达沉默:HbBart’s胎儿水肿综合征(死胎)常见区域

常见与远东地区,非洲和地中海区国家

2021/10/1011其他特征HbHHbA2HbF贫血小红细胞靶细胞异常出生时少量的(~2%)HbBart’s0正常正常000一条链缺失出身时HbBart’s(~5%)0正常或减少正常0002条链缺失不稳定血红蛋白溶血性贫血(HbH)10-15%减少也许增加轻微的到严重的++3条链缺失胎儿水肿综合症(hydropsfetalis)00100%HbBart’s严重的--4条链缺失2021/10/1012基因型诊断血常规临床症状检测结果aa/aa无HbA

:NHbA2

:N(2-3.5%)-a/aaa-Thalassaemia

2杂合体(静止型)轻微小红细胞症MCV

:75-80fLMCH:20-24无HbAandHbA2:NHbBart’s0-3%atbirthConfirmationbymolecularbiology-a/-aa-Thalassaemia

2纯合体小红细胞症血红蛋白减少Hb:11-12g/dL无明显临床症状HbAandHbA2:NHbBart’s2-8%atbirth--/aaa-Thalassaemia

1杂合体MCV:65-75

MCH:20-24需要分析序列分析或DNA序列分析

--/-aHbH小红细胞症血红蛋白减少Hb:8-11g/dLMCV

:55-65MCH:20-24出现溶血

脾脏肿大HbA2NorHbBart’s<5%HbH10-20%--/--a-Thalassaemia

1纯合体(死胎)严重贫血水肿胎Hb:8-11g/dLMCV100-110MCH无法存活死胎AbsenceofHbAandHbFHbBart’s80-100%HbPortland<5%2021/10/1013镰刀型红细胞血症变异体出现在6GAG(谷氨酸)GTG(缬氨酸)NSSASabnormalgenenormalgeneNHbSNNHbSASNHbAHbSNNSSHbAHbSChromosomes16a2a1a2a1HomozygoteChromosomes11HétérozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgChromosomes16a2a1a2a1HomozygoteChromosomes11HeterozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGg2021/10/1014C型血红蛋白分子病

变异体位置:AA6:GAG(谷氨酸)AAG(Lys)HbAHeterozygoteACHbAHbCNHbASCCompoundheterozygotyHbAHbCNHbSHétérozygotecompositeACSCChromosomes16a2a1a2a1HomozygoteChromosomes11HétérozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgChromosomes16a2a1a2a1SCheterozygotecompoundChromosomes11HeterozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGg2021/10/1015D型血红蛋白分子病常见区域:常见于印度.特点:变异体位置b121Glu(谷氨酸,负电荷)

→Gln(谷氨酰胺,不带电荷)

(D-LosAngeles=D-Punjab)(6differentHbDaccordingtothepositionofthemutation)碱性缓冲液中:电荷下降

→M电泳速度变度变慢,靠近HbS临床症状:基因杂合体:无症状(仅在电泳中发现D区带)HbAfraction:65–70%HbDfraction:30–35%基因纯合体:轻微贫血HbAfraction:absenceHbDfraction:100%2021/10/1016E型血红蛋白分子病常见区域:常见与东南亚地区.特点:变异位点b26Glu(谷氨酸,负电荷)

→Lys(赖氨酸,正电荷)碱性缓冲液:总体带电荷下降→凝胶电泳中,出现在HbC附近临床症状:杂合体:无症状HbAfraction:65–70%HbEfraction:30–35%基因纯合体:轻微贫血HbAfraction:absenceHbEfraction:100%2021/10/1017下列情况下,需要进行血红蛋白检测

临床和遗传问题(产前诊断)

贫血,小红细胞症

新生儿筛查

对来自地贫高发区人口,进行筛查

…

对诊断有帮助的其他信息

患者临床症状,年龄,籍贯和其他相关的背景 (输血记录)

血液全套检测,网状细胞级别和进行细胞形态镜检

Hb电泳(EDTA抗凝管)

离子平衡和溶血情况

2021/10/1018血红蛋白检测的几种方法目前,血红蛋白检测步骤如下: -电泳法对Hb进行检测

或者使用等电聚焦电泳法 -使用HPLC法进行确认.2021/10/1019凝胶电泳结果识别表

2021/10/1020在pH梯度的凝胶片上,根据蛋白不同的等电点,对蛋白进行分离Hb电泳位置取决于缓冲液PH值蛋白电泳至其等电点位置后,停止泳动AtpI=pH,Hbdoesnothaveanetchargeandstopsmigrating电泳分离效果好,但时间长.需要经验丰富才能获得良好结果及进行结果判断等电聚焦电泳法2021/10/1021介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法: -通过毛细管电泳法,即可以获得与IEF方法一样的分辨率,同时检测结果量值HbA2/HbF同样精确. -出现异常变异体后:

使用下列方法确认: *ITANOtest(solubilitytest) *HPLC液相色谱 *Genotyping基因筛查2021/10/1022Capillarys2Minicap全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测Capillarys2/Minicap2021/10/1023毛细管电泳法原理

Peltier温控桥Anode+Cathode-检测器氘光灯电泳高电压2021/10/1024此时,电渗力(EOF)远远强于电场力.因此,蛋白被动从正极向负极端移动.正电极+EOF负电极-Electro

migration蛋白电泳DETECTIONINJECTION带正电荷的缓冲液毛细管壁负离子鞘2021/10/1025Capillarys/Minicap血红蛋白电泳血红蛋白条带,在电渗力的作用下,8分钟即完成电泳过程,然后,在415nm紫外光下被检测并显示出来.正常质控品必须在每天检测前使用Capillarys:-检测速度:40样品/小时试管架1至7号位放置样品,8号位放4ml溶血素Minicap:-检测速度:10样品/小时试管架1至26号位放置样品,27号位放溶血素(8个样品消耗5ml溶血素)2021/10/1026Capillarys/Minicap血红蛋白检测标本要求抗凝管采血(EDTA,heparin,citrate).如果需要对输血患者采血,需要在输血前采集血液.使用去除血浆后的红细胞(隔夜或5000rpm,5分钟离心后样品)+4°C以上,标本最多存放7天.需要长期存放,可以洗涤红细胞后,放置于-80°C(可存放至少3个月)2021/10/1027CapillarysMinicap血红蛋白条带识别表Capillarys/Minicap区带识别表Z15:HbHZ14://Z13:Hb-JRovigo,HbN-Baltimore,J-KaoshiungZ12:HbBart’s,HbProvidence,HbJ-Mexico,HbJ-Baltimore….Z11:HbKaoshiung(NewYork),denaturatedHbAZ10:HbHope,HbM-IwateZ9:HbA,HbCamperdown,HbPhnomPenh……Z8:AcetylatedHbF,HbAltanta,HbAthens-GAZ7

:

HbF,denaturatedHbS,HbPorto-Allegre……..Z6:HbD-Punjab,HbPhiladelphia,HbKorle-Bu,HbLepore,HbKöln,denaturatedHbE….Z5:HbS,HbHasharon,HbHandsworth,denaturatedHbO-Arab.Z4:HbE,denaturatedHbC,HbKöln,HbA2variants,M-IwateHbA2variantsZ3:HbA2,HbO-ArabZ2:HbC,HbConstantSpring,SetifHbA2variantZ1:HbdA2HbaA2,HasharonHbA2variant,WinnipegHbA2variant……2021/10/1029正常HbA2

质控品条带结果可录为QC2021/10/1030HbAFSC质控品,可用来作为参照曲线,

便于异常结果的判断2021/10/1031HbsA,F,A2

检测结果可通过颜色进行区分

异常区带显示为灰色2021/10/1032主要异常血红蛋白变异体Z15 ↔HbHZ12 ↔HbBartZ10 ↔HbHopeZ9↔HbA

Z7↔HbFZ6↔HbDPunjabZ5↔HbSZ4↔HbEZ3↔HbA2Z2↔HbCHbEHbSHbH2021/10/1033

HbS变异体,HbA2正常值

β6Glu→ValHbA=22HbS=2S2HbA2=222021/10/1034Capillarys/Minicap血红蛋白试剂优势:无需前处理(不需要洗血和溶血)，直接检测血红蛋白C和E能从A2分离开根据S型和D型的细微电荷区别,进行区分.对于处于A和S之间的F给予个性化和聚焦的精确量化.对A2型血红蛋白有很好的分辨率和分离效果HbBarts和HbH可以很好的检测和量化糖化型血红蛋白电泳出现在主体峰内,不影响检测结果2021/10/1035异常结果分析2021/10/1036Case2:

31YFemale,血红蛋白12.8,红细胞压积37.4(I)A=84.1%F=1.5%A2=5.5%2021/10/103731YFemale,Hgb12.8,Hematocrit37.4(II)AlkAcidFSCA2CSFß-thalassemia-轻型A2AAAACPCPA=93.4%,F=1.1%,A2=5.5%2021/10/1038HbA92.5%HbF2.6HbA24.9%HbFHbAHbA267YfemalefromTunisia,Hgb9.1,hematocrit28,MCV62小红细胞症;betathalassemia轻型2021/10/1039HbH4%HbA94.7%HbA21.3%HbAHbA2HbHChild9Y,fromLaos,Hgb8,hematocrit27.9,MCV54.1严重小红细胞症;血红蛋白H病，需要基因筛查2021/10/1040HbHandBart’s-Alpha-thalassemia

HBarts

2021/10/1041Case1:

13YMale,Hgb8.1,Hct24.0(I)A2=6.1%S=82.8%2021/10/1042Case1:13YMale,Hgb8.1,Hematocrit24.0(II)AlkAcidFSCSA2+FCSFS

HgbF/S,A2=4.6%+betathalassemiaminorA2AFACPCP2021/10/1043Case2:

65YMale,Hgb9.4,Hematocrit27.3(I)Co-migrationwithA2A=62.1%A2=31.7%*2021/10/1044Case2:HbEMigratesSeparatelyFromHbA2

β26Glu→Lys2021/10/104521Y,pregnantwoman,Hgb13.1,hematocrit38.6HbA95%HbF2.1%HbA22.9%Normalpattern,HbFslightlyincreased(pregnancy)2021/10/1046Baby2monthsold,fatherfromMartinique,motherfromCentralAfrica,Hgb11,hematocrit29.8HbF49.5%HbS25.9%HbA21.8%HbC22.8%HbFHbSHbA2HbCSCcompoundheterozygoty2021/10/1047Diabeticpatient,54Y,Hgb14.5,hematocrit43.5,MCV88HbA1cmeasurement(HPLCTosoh)HbA54.7%HbX41.7%HbA23.6%HbAHbA2HbXNormalhemogram;compatiblewithheterozygoteA/D;Tobeidentifiedbygenotyping2021/10/1048HbA51.8%HbA22.9%HbC35.9%HbAHbA2HbCDiabeticpatient,61Y,Hgb11.6,hematocrit34.8,MCV85Slightanemia;compatiblewithheterozygoteA/CTobeidentifiedbygenotyping2021/10/1049Adoptedchild,4Y,originatedfromHaiti,Hgb10.9,Hematocrit31.3,MCV76.9HbA97.5%HbA21.4%HbX1.1%HbAHbA2HbXSlightanemia;heterozygousDeltamutation,asymptomatic2021/10/1050Diabeticpatient,73Y,Hgb10.2,hematocrit30.8,MCV87.3Alphachainmutation;genotypingconfirmation:HbWinnipega75AspTyrHbA-WiHbA2-WiHbAHbA22021/10/1051HbA90.3%HbF3.8%HbA25.9%HbAHbFHbA2HbA64%HbS33.1%HbA22.9%HbAHbSHbA2HbA2.2%HbF67.3%HbS29.1%HbA21.4%HbAHbFHbSHbA2Father:BetathalassemiaminorMother:HeterozygoteASBaby2monthsold:AssociationS-betathalassemia2021/10/1052HbLeporeonMinicap/CapillarysANAlc.A2LeporeNAc.A0+

LeporeA1HbA2HbAHbFHbLeporeAFSCcontroloverlaying2021/10/1053HbLeporeb和d链重新组合形成.在碱性缓冲液下电泳:总体带电荷下降→电泳位置出现在S型血红蛋白附近基因杂合体:HbLeporefraction:5–15%Clinicalsignsofminorbthalassemia基因纯合体:HbLeporefraction:about30%Clinicalsignsofhomozygousbthalassemia常见区域:Lepore(-Boston–Washington):

常见于意大利人群;同样常见于在罗马尼亚,澳大利亚和墨西哥人群.特点:2021/10/1054a47Asp→HisHbHasharonHbAHbA2HbFHbHasharonHbHa-A2HbO-Arabb121Glu→LysHbA2+O-ArabHbFHbA2021/10/1056DIAGNOSTICFLOW-CHART2021/10/1057ANEWFASTHEMOGLOBINELECTROPHORESISMETHODFORDRIEDBLOODSPOTSONSEBIACAPILLARYS™AUTOMATEDSYSTEM

2021/10/1058现有的新生儿血红蛋白筛查方法(SCD)

新生儿血红蛋白检测:

*等电聚焦

(IEF)

*高效离子交换液相色谱法(CE-HPLC).

毛细管电泳方法可取代常规,操作复杂的等电聚焦方法2021/10/1059新生儿血红蛋白快速检测法取血板BSD600全自动打孔器全自动溶血,样品稀释和检测溶血剂样品条码识别：取血板条码＋样品稀释杯条码使用纯净水洗脱样品2021/10/1060与IEF方法比较,毛细管方法优势对于常见异常血红蛋白变异体有100％区分能力(HbS,C,D,E)对其他非常见变异体有良好检测能力对不同类型样品拥有相同检测能力：新生儿,早产儿或者进行过输血患儿样品全程检测溯源性:取血板和样品稀释杯使用条码高效性(48个样品/小时),576样品/天4小时人机分离操作,最多可进行3X192个样品检测可选择使用与毛细管匹配的全自动打孔机,完全自动化处理样品无需人工进行样品转移,避免交叉污染该项目检测完全自动化:从前处理到检测,直到结果分析,全程无需人工干预.2021/10/1061使用标准取血板,在室温下进行干燥.干燥的取血板可在2-8°C下,保存1个月.

新生儿血红蛋白检测的样品要求通过颜色区分正常及异常样品正常血样:

withHbFandHbA

(+acetylatedHbF)异常血样2021/10/1063提供样品检测完整溯源性通过样品ID,试剂杯和全自动打孔器的数据记录完成数据交换异常样品自动显示2021/10/1064电泳图谱说明:*检测到条带的位置,图谱会自动定位*鼠标经过的区带位置,会显示出该区带的所有可能出现的异常血红蛋白名称.(N1toN13).新生儿血红蛋白检测条带名称识别表N13:HbBart’sN12://N11:HbHope,Gammachainvariants,denaturedHbAN10:HbAN9:DenaturedHbFN8://N7:HbFN6://N5:HbD-Punjab,HbG-Philadelphia,HbKorle-BuN4:HbS,acetylatedgammachainvariantsN3:HbE,HbF-OuledRabah,gammachainvariants,MethemoglobinN2:HbA2,HbO-Arab,HbF-OuledRabah,gammachainvariantsN1:HbC2021/10/1066正常血样HbFHbABirth:19/01/06Samplecollection:24/01/06Term:39w.Weight:3445g2021/10/1067输血后检测结果Birth:29/01/06Samplecollection:01/02/06Term:38w.Weight:3100g2021/10/1068F/ShomozygoteBirth:05/01/06Samplecollection:08/01/06Term:37w.Weight:3490gHbSHbFDenaturedHbF2021/10/1069早产儿体内的F/SDenaturedHbFHbFHbSBirth:20/02/06Samplecollection:23/02/06Term:34w.Weight:1300g

2021/10/1070F/SCcompoundheterozygoteDenaturedHbFHbFHbSHbCBirth:30/01/06Samplecollection:02/02/06Term:40w.Weight:3900g2021/10/1071F/ASheterozygoteHbAHbFHbSBirth:16/12/06Samplecollection:19/12/06Term:36w.Weight:2780g2021/10/1072F/ChomozygoteHbFHbCDenaturedHbFBirth:20/12/05Samplecollection:24/12/05Term:39w.Weight:3160g2021/10/1073F/ACheterozygoteBirth:18/12/06Samplecollection:21/12/06Term:40w.Weight:3035g2021/10/1074F/ACinaprematurenewbornBirth:17/10/05Samplecollection:20/10/05Term:30w.Weight:2330g

2021/10/1075F/ADheterozygoteBirth:29/01/06Samplecollection:31/01/06Term:37w.Weight:3280g2021/10/1076