鱼骨钙肽螯合物的制备和性质

鱼骨钙肽螯合物的制备和性质.前言1.1鳕鱼的基本成分及研究现状 随着我国渔业捕捞与养殖产业的不断发展，水产品的产量逐年增加。我国渔业养殖产量约占全球养殖产量的70%，是世界上国家中唯一养殖产量超过捕捞量的国家。据统计，2008年我国淡水产品的总产量就高达2000多万吨，较去年增长了3.12%[1]。水产品产量逐年增加的同时产生的下脚料如鱼头、鱼骨等也越来越多。目前我国对下脚料的利用方面主要集中于水解蛋白、鱼露等方面，如何高效地利用水产品下脚料成为了当今热门研究的一个重要方面，也是推进科学发展观、建设高效节能社会的一项重要举措。鳕形目鱼类作为一种分布及其广泛的鱼类，在各大洋均有分布。这种鱼类生活主要生活在深海中下层以及底层，属于冷水性鱼类的范畴[2]。其中鳕科和无须鳕科中有需要中重要的经济鱼类，具有较高的经济价值。鳕鱼是我国远洋捕捞的重要捕捞鱼种之一，每年的捕捞量超过10万吨，本研究以鳕鱼骨为原料，对其进行高效利用，有望开发一种高效胶原蛋白提取工艺及高效钙补充剂，推进深海鱼的综合开发利用。1.2胶原蛋白1.2.1胶原蛋白的概述胶原蛋白的定义是：一种结构蛋白，主要存在于细胞外基质（ECM），结构中含有由α链组成的一个或数个三螺旋结构区域，即胶原域[3]。胶原蛋白作为一种生物组织结构蛋白，是生物机体结缔组织和间质组织主要的纤维组织成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的一类功能性蛋白，占蛋白总量的25%左右。在许多海洋生物体内，胶原蛋白占总蛋白含量高达80%以上。有支撑保护机体、结合及形成界隔等作用，还具有转导信号、运输细胞因子和生长因子等功能。胶原蛋白作为在食品、医药、组织工程、化妆品等领域被广泛研究的重要蛋白质，具有优良的生物相容性，易生物降解性，低抗原性的特性使得其在人体更易被人体吸收，同时能促进细胞的成活生长，促进血小板的凝结等[4]。1.2.2胶原蛋白的分类表1-1胶原蛋白的类别、组成及其在组织中的分布（Gelseetal.，2003）[3]Table1-1Compositionanddistributionofvariouscollagentypes其中成纤维胶原蛋白含量最丰富，分布最广泛。占胶原蛋白家族的90%左右。但由于胶原蛋白的结构组成、复杂程度各不相同，且存在着非螺旋结构域、聚集特性和功能等的差异，因此被划分为多种类型[21]。被发现且已报道的胶原蛋白就多达26种（Gelseetal.，2003）。1.2.3胶原蛋白的理化性质凝胶特性胶原蛋白凝胶的形成，是胶原蛋白分子之间以及胶原蛋白与溶剂之间展开相互作用的共同结果。凝胶过程主要包括蛋白分子结构的变形、有序再排列，到最后三维网状结构的形成[5]。形成的网状结构能固定较多的水分。但其凝胶强度依然有限，在改善胶原凝胶的凝胶强度和抗降解能力，目前主要研究的方法包括紫外线照射交联、热交联、高压处理以及化学交联剂戊二醛等[6]，但是研究发现化学交联剂对人体具有一定的毒性，因此现阶段寻找优良的天然交联剂成为新的研究热点。热稳定性不同胶原蛋白的氨基酸组成存在差异。而亚氨酸（指脯氨酸和羟脯氨酸）的含量是胶原蛋白热稳定性的决定性因素之一[7]。研究发现，深海冷水鱼类的亚氨酸含量低于哺乳类动物。其它性质胶原蛋白分子之间相互作用产生的性质，如凝胶性、沉淀性等[8]；蛋白质与水相互作用的性质如持水性、吸水性、溶胀性和黏度等；已经发泡性、乳化性等表面性质等。1.2.4胶原蛋白的应用化妆品中的应用化妆品的组成、结构及功能特点决定了其具有美容、保湿、防皱、修复、减肥等功效。胶原蛋白作为脊椎动物结缔组织中的一类非水溶性纤维蛋白质，对人体皮肤具有重要作用和意义[9]。因胶原蛋白的结构与人体皮肤胶原的性质相似，所以将其作为活性物质用于化妆品中时，胶原蛋白可扩散至深层皮肤，修复补充甚至增强皮肤本身的胶原蛋白活性，保持角质层水分的稳定性和纤维结构的完整性[10]。促进皮肤组织新陈代谢、皮肤除皱保湿等作用。生物材料中的应用胶原蛋白具有较强的亲和力、较弱的抗原性、良好的生物相容性和生物降解安全性等的特点，使得胶原蛋白可作为性能优良的生物材料。目前应用主要有：制作止血粉、皮肤移植材料、组织工程支架等[10]。饲料方面的应用以制革的残次皮料、皮角余料等为原料、主要运用物理和化学的方法处理得到蛋白质产品。水解胶原蛋白作为动物源蛋白营养添加剂之一，替代或部分替代鱼粉，应用于混合饲料中，具有良好的营养效果和经济效益[11]。1.3生物活性肽1.3.1生物活性肽的概述生物活性肽（BioactivePeptides，BAP）是一类相对分子质量不大于6000Da、对生物生命活动具有多种生理学功能的肽类化合物的总称[20]。天然存在的活性肽包括肽类化合物、激素等生物次级代谢产物以及各种组织生物系统如骨骼、肌肉、消化、中枢神经系统中存在的多肽[12]。目前研究较多的海洋活性肽主要来源于海鞘、海星、海藻、海胆、鱼贝类等的活性肽以及海洋生物中分布广泛的生物防御素[13]。1.3.2生物活性肽的结构生物活性肽的结构是介于氨基酸和蛋白质之间的一种几个或几十个不同氨基酸组成，通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰以及不同的排列顺序而形成的一种复杂程度各异的多肽。多数生物活性肽通常情况下以非活性结构形式存在于蛋白质链中，在发挥作用之前会被特异的蛋白酶水解出来并转运至作用部位发挥功效。1.3.3生物活性肽的功能及利用生物活性肽具有广泛的生理功能，如免疫调节、抗高血压、降胆固醇、抑菌、抗病毒甚至抗癌等优良功效[14]。而这些功能是蛋白质和分解后的氨基酸所不具备的，且许多生物活性肽的组成氨基酸是非必需氨基酸，为人们一直认为生物效价不高的蛋白质资源提供了光明的前景。生物活性肽不仅具有多种人体代谢和生理调节功能，同时易被人体消化吸收,由动物蛋白水解后的多肽制成的补钙剂，使得小肠对钙的吸收增加，同时有利于钙在骨骼中的沉积，且这种吸收方式不需要VD的参与[15]。而人体一般都是通过日常饮食摄入一定量的蛋白质、脂肪等大分子高聚物，蛋白质通过蛋白酶水解为多肽，然后再经过各种因子的激活才能转化为生物活性肽发挥作用，糖类则通过糖酵解、三羧酸循环等途径来实现转化。如果在体外通过酶解等途径先转化为活性肽再摄入体内，这样不但降低了过敏性蛋白对特定人群的影响，有利于人体的消化吸收，同时减少了大分子蛋白质在体内的代谢过程，降低了代谢产生的有害物质对人体带来危害的风险。1.4钙的介绍1.4.1钙的分布及重要性钙是人体代谢和各种生理活动的重要元素之一，对人体的生命健康有着不可替代的作用[16]。人体质量的1.4%都是钙。总重约1200g至1300g[17]，无论在神经、骨骼、血液中，都含有Ca2+结合的物质。99%钙以骨盐形式存在于骨骼和牙齿中，骨骼中的钙主要以非晶体的磷酸氢钙（CaHPO4）和晶体形式的羟基磷灰石（Ca10（PO4）6（OH）2）两种形式存在，同时骨骼又是钙沉积的主要部位，因此素有“钙库”之称。构成人体的结构骨架。剩下的1%参与人体的新陈代谢，神经传导、肌肉收缩、激素释放、血液的凝结等均缺少不了钙的参与。而钙代谢的平衡与否是衡量人体健康的重要因素之一[18]。营养研究调查发现，我国居民人均钙摄入量普遍较低，仅达到推荐用量的40%至50%左右。而钙摄入量的缺少会导致多种疾病，同时也必将影响到人体的正常生理代谢和新陈代谢。1.4.2人体钙吸收代谢机理人体的十二指肠和空肠是钙吸收的主要场所。钙的吸收主要包括两个途径：（1）饱和的跨细胞途径，受钙结合蛋白（CaBP）调节；（2）不饱和的旁细胞途径，不直接受到营养性或功能性因子的影响。跨细胞途径主要在近端肠（主要是十二指肠），主要包括三个步骤；（1）刚进入肠细胞的纹状缘；（2）细胞自身的运动；（3）伸出基侧膜。而旁细胞吸收途径则存在于整个消化肠道。钙进入细胞是顺电化学梯度的过程，并且会尽可能的利用钙通道；而钙从肠细胞内“排出”是逆电化学梯度的一个过程，且受到Ca-ATP酶的调节，排出过程受到维生素D的调节，但不受速率的影响。钙到达基侧极与横跨基侧极的Ca-ATP酶结合，然后进行磷酸化使得Ca-ATP酶构象的改变。最终通过相应的“通道”排出[19]。1.4.3居民补钙情况表1-22002年中国居民营养与健康状况调查[23]Table1-2SurveyonnutritionandhealthofChineseresidentsin2002人群年龄推荐摄入量（RNI）（mg/日）实际摄入量（mg/日）＜6个月4003006个月~3岁6003003岁~11岁80030011岁~13岁100040013岁~16岁120040016岁~18岁1000400＞18岁800-1000500孕妇早期/孕妇晚期/乳母1000/1500/1500600/800/800老年人1000300通过表1-2我们不难发现，我国居民人均钙摄入量普遍较低，仅达到推荐用量的40%至50%左右。而钙摄入量的缺少会导致多种疾病，必将影响到人体的正常生理代谢和新陈代谢。钙质摄入不足不仅是我国居民营养问题，更是全球性的营养问题。全球各个地区的营养膳食结构不同，我国居民主要以植物性膳食为主，而蔬菜谷物中的植酸、草酸等会与钙形成不易被吸收的不溶性植酸钙和草酸钙，从而影响人体对钙的吸收利用。因此较食用乳制品较多的欧美、澳大利亚等国家而言，缺钙的现象尤为严重。这些表明，钙摄入不足是我国各人群急需解决的问题。2.实验材料及设备2.1主要试剂TCA（三氯乙酸)湖北兴和化工有限公司高氯酸上海谱振生物科技有限公司氯胺-T上海建平化工有限公司4-二甲氨基苯甲醛Sigma公司丙烯酰胺Sigma公司酒石酸钾钠上海鹤善实业有限公司茚三酮博研(上海)生物技术有限公司Hyclone胎牛血清Sigma公司干酪素上海士锋生物科技有限公司酪氨酸江苏张家港市思普生化有限公司甘氨酸江苏张家港市思普生化有限公司羟脯氨酸Sigma公司果糖湖北远成赛创科技有限公司NaCO3，NaOH，CuSO4·5H2O，NaH2PO4·2H2O，KH2PO4，Na2HPO4·12H2O，无水乙醇，异丙醇，无水氯化钙均为国产分析纯。2.2主要酶制剂中性蛋白酶Sigma公司胰蛋白酶Sigma公司木瓜蛋白酶Sigma公司2.3主要仪器全自动高温高压灭菌锅上海茸研仪器公司小型高速粉碎机湖北振华医疗器械有限公司DS-1组织粉碎机上海比朗仪器有限公司普通天平（准确至0.001g）上海安谱实验科技股份有限公司精密电子分析天平(准确至0.000001g)梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司SHA-B恒温震荡器国华电器有限公司冷冻干燥器德国MarinChrist公司LX-200微型离心机海门市其林贝尔仪器公司TG16MW台式高速离心机湖南赫西仪器装备有限公司电泳仪北京市六一仪器厂SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司WFZUV-2100型紫外可见分光光度计尼柯（上海）仪器有限公司PHS-3CpH计上海仪电科学仪器股份有限公司移液枪赛默飞世尔科技有限公司XW-80A微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公司HY-881-2型电热鼓风干燥箱苏州市豪悦电热设备制造厂电磁炉美的集团2.4主要试剂的配制2.4.1福林试剂（Folin试剂）清洗安装2000mL磨口回流装置，在装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，小火微沸回流10h。卸下冷凝器，然后加入50g硫酸锂（Li2SO4），50.0mL蒸馏水，震荡摇匀，再想其中加滴入少许液溴，沸水浴15min，以驱逐残溴除去颜色，使得溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需重复上述步骤，继续加几滴溴液，再煮沸除去之。室温下冷却后，定容至1000mL，用细菌漏斗（No4~5)过滤后置于棕色瓶中保存备用。若此溶液稀释浓度为原来的三分之一时，即是后续使用的福林试剂使用液。2.4.2碱性铜试剂Folin-酚试剂甲液的配制是由A液与B液按50:1的比例混合即成。此试剂只能使用1天。A液的配制：4%碳酸钠（Na2CO3）溶液与0.2mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液等比例混合；B液的配制：1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液与2%酒石酸钾钠溶液进行等比例混合。2.4.32%酪蛋白溶液使用分析天平准确称取干酪素2g，精确至0.002g，加入10mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液，在沸水浴中适当加热使其溶解，然后用pH7.2磷酸缓冲液定容至100mL，配制成的溶液即是2%酪蛋白溶液。配制后应及时使用或放入4℃冰箱保存。2.4.4100ug/mL酪氨酸溶液准确称取0.1000g在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸，逐滴加入6.0mL1mol/L盐酸使其溶解，用0.2mol/LHCl定容至100mL，其浓度为1000ug/mL，再吸取此液10.0mL，以0.2mol/L盐酸定容至100mL，即配成100ug/mL的酪氨酸溶液.配成后也应及时使用或放入4℃冰箱保存。2.5.5pH7.5磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.50g以蒸馏水溶解定容至1000mL。3实验方法鳕鱼样品去除鱼皮鱼排人工取鱼肉酶解鱼排上的鱼肉福林酚法测鱼肉蛋白含量鱼骨鱼骨预处理酶解鱼肉热水抽提法提取鱼骨蛋白茚三酮比色法测水解度福林酚法测鱼骨蛋白含量鱼骨蛋白中羟脯氨酸含量的测定鱼骨蛋白SDS电泳冷冻干燥法制取干鱼骨粉蛋白酶活力的测定鱼骨蛋白酶解的酶用量实验酶解条件优化试验茚三酮比色法测水解度SC-P-Ca（钙肽螯合物）的制备SC-P-Ca的红外光谱分析图3-1实验工艺流程图Figure3-1Experimentalprocesschart3.1鳕鱼骨预处理将鳕鱼从冷库中取出并解冻，取出杂质并用自来水冲洗干净。采用适宜的酶解条件和酶解方法酶解，最后清洗收入封口袋置于冰箱冻藏备用。3.2热水抽提鱼骨明胶实验（胶原蛋白）3.2.1提取工艺流程取酶解处理后的鱼骨→称取30.0g干鱼骨→鱼骨粉碎（过200目筛）→高温高压灭菌锅中处理30min→按料液比1:3的比例加水并于高速粉碎机中制成匀浆→70℃震荡水浴锅中热水抽提胶原蛋白4h→高速离心机离心并取上清液→存于4℃冰箱备用。3.2.2提取率的测定（1）Folin-酚法测定蛋白含量标准曲线的绘制： 取7支试管，编号后，分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1.0mL，使每管含蛋白量分别为0ug、25ug、50ug、100ug、150ug、200ug、250ug。在每支试管中用移液枪分别加入5.0mL甲液，震荡摇匀，在30℃恒温水浴锅中放置10min。再在每支试管中加入0.5mL乙液，立即震荡混匀，30℃水浴锅中保温30min。准确到30min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nm下用1CM光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定吸光值。图3-2牛血清蛋白标准曲线

Figure3-2Bovineserumproteinstandardcurve样品的测定：将提取的上清液进行适当的稀释后，取1.0mL稀释后的样液于试管中，其他步骤与标准曲线一致，以标准曲线中的0mL标准蛋白液管为空白，测定吸光值。根据标准曲线得出样品中蛋白含量。η1=X1/Y1×100%η1：提取率（%）X1：提取上清液中蛋白含量Y1：原料中蛋白含量（2）羟脯氨酸含量的测定羟脯氨酸作为胶原蛋白的特征氨基酸，通过测定羟脯氨酸的含量可间接衡量胶原蛋白的含量。试剂的配制：缓冲液配制：分别称取15.0g柠檬酸，45.0g醋酸钠及7.5g氢氧化钠，少量蒸馏水溶解后转移至500mL容量瓶。添加甘油145.0mL，最后蒸馏水定容溶液至刻度。高氯酸溶液：取70%高氯酸溶液27.0mL，定容至100mL。氯胺T试剂：称取1.41g氯胺-T，使用上述缓冲液100mL进行溶解（放置5℃冰箱中可保存一个月）发色剂配制：称取4-二氨基苯甲醛10.0g，使用上述高氯酸溶液35.0mL进行溶解，慢慢加入65.0mL异丙醇并不断轻轻摇动。标准曲线的绘制：准确称取100mg烘干至恒重的羟脯氨酸粉末，蒸馏水溶解配制成浓度为1.0mg/mL标准液。取1.0mL标准品贮备液稀释至100mL，配制成浓度为10ug/mL的标准溶液，现用现配。分别取0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL标准溶液于各试管中，用蒸馏水补足到2.0mL。各试管中分别加入1.0mL氯胺-T溶液，25℃下放置20min。再各加入1.0mL发色剂，充分震荡后放入60℃恒温水浴锅水浴15min，使用流动的自来水对试管进行冷却3min至10min。在560nm处检测吸光值，并绘制标准曲线。图3-3羟脯氨酸标准曲线Figure3-3Hydroxyprolinestandardcurve样品的测定：称取2-3mg样品，放于安培瓶中，依次加入6mol/LHCl（3mL），酒精喷灯封口，在130℃下进行水解4h。取1.0mL水解液于100mL容量瓶中，滴入少许0.02%甲基红指示剂，加入适量的NaOH溶液，调节溶液颜色直至淡黄色，之后用蒸馏水定容至100mL。取2.0mL上述溶液，用空白组样品液进行调零，在560nm处测定吸光度值，根据羟脯氨酸标准曲线计算出样品中羟脯氨酸含量，然后进行胶原蛋白含量的换算（×11.1）。η2=X2/Y2×100% η2：提取率（%）X2：提取上清液中羟脯氨酸含量Y2：原料中羟脯氨酸含量3.2.3工艺优化试验（1）单因素试验表3-1抽提胶原蛋白优化工艺参数Table3-1Collagenextractionprocessparametersoptimization12345高温高压软化处理（min）1020304050料液比1：21：31：41：51：6提取温度（℃）5060708090提取时间（h）246810采用4因素5水平单因素试验对热水抽提胶原蛋白工艺进行优化。提取的胶原蛋白含量的多少作为该优化试验的评价指标。（2）响应面试验选取料液比、高温高压软化时间和水浴抽提温度3个因素进行响应面试验设计，设计如下：表3-2Box-Behnken设计试验因素水平及编码Table3-2TestfactorsandlevelsandcodesinBox-Bchnkencentralcompositedesign自变量水平编码编码水平-101料液比X11：31：41：5高温软化时间（min）X2405060提取温度（℃）X3708090表3-3响应面试验设计表Table3-3Responsesurfacetestdesigntable实验编号X1X4（min）X3（℃）110121-103-1104000500060-117-10-180009011100001101-11211013-1-10140-1-11500016-1011710-1采用羟脯氨酸法测定蛋白的提取率，测定的羟脯氨酸含量的多少作为该优化试验的评价指标。3.3鱼骨胶原蛋白的SDS电泳实验采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）方法（LaemmLi1970）对鱼骨蛋白样品进行分析。取干鱼骨蛋白粉，用0.5mol/L醋酸溶液溶解，调节pH为中性，配制成浓度为1.0mg/mL的鱼骨蛋白样品溶液。取60ul样品溶液，分别加入20ul4×样品缓冲液，在沸水浴中煮沸2~10min，用微型离心机离心3~5min。取20ul上清液上样。浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%，使用SDS-Tris-甘氨酸系统的电极缓冲液（含0.1%SDS，pH=8.3）进行电泳。采用电压为100V的直流恒压电源，电泳2~3h。结束后放入平板中染色20min，后进行脱色[21]。3.4蛋白酶活力测定（SB/T,10317-1999)3.4.1标准曲线的绘制准确称取烘干至恒重的酪氨酸10mg，用蒸馏水定容至100mL，即成100ug/mL酪氨酸溶液。向6支试管中分别加入0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL的酪氨酸溶液，并补足至10.0mL，得到稀释后的酪氨酸浓度分别为0ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、60ug/mL、80ug/mL、100ug/mL。取6支试管分别加入不同浓度酪氨酸溶液1.0mL，各加入0.4mol碳酸钠5.0mL，再分别加入已稀释的Folin试剂1.0mL。震荡摇匀后，40℃水浴保温发色20min，在波长660nm下分别测定吸光值。一般测定3次，取平均值。以0ug/mL作为空白调零。表格如下：表3-4标准曲线实验表Table3-4Standardcurvetesttable试剂管号123456不同浓度酪氨酸(mL)1.01.01.01.01.01.00.4mol/LNa2CO3(mL)5.05.05.05.05.05.0Folin试剂(mL)1.01.01.01.01.01.0OD值102030平均0以酪氨酸的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

图3-4酪氨酸标准曲线Figure3-4Standardcurveofthetyrosine3.4.2样品稀释液的制备准确称取酶粉50.00mg，加入pH7.2磷酸缓冲液定容至50mL，吸取此液5.0mL，再用缓冲液稀释至25mL，即成5000倍酶粉稀释液。3.4.3样品的测定各取1.0mL样品稀释液，在40℃恒温水浴锅中预热2min，各加入1.0mL同样40℃预热的酪蛋白，精确保温10min，保温结束后立即加入2.0mL0.4mol/L三氯乙酸溶液以终止反应，继续置于40℃恒温水浴锅中保温20min，使不溶性蛋白质沉降，于6000r/min高速离心机中离心5-10min，取上清液。取各滤液1.0mL，加0.4mol/L碳酸钠5.0mL和已稀释的Folin试剂1.0mL，摇匀，40℃保温发色20min，后进行吸光值测定。同时做空白试验和平行试验。3.4.4计算在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。蛋白酶活力单位（干基）=A/10×4×N×1/（1-W）式中：A-样品的OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数4-4mL反应液取出1.0mL测定；N-酶液稀释的倍数；10-反应10分钟；W-样品水分百分含量。3.5鳕鱼鱼肉的酶解工艺3.5.1预处理首先取冷冻鳕鱼样品，用自来水冲洗30min至60min进行化冻处理。人工去除鱼皮并采取一定量鱼肉，按1:1的比例加入蒸馏水，组织匀浆器以一定的转速对鱼肉进行匀浆处理，处理后置于4℃冰箱保存。3.5.2操作步骤（1）酶解鱼肉匀浆液取鱼肉匀浆液5.00g置于锥形瓶中，按料液比1：4加入蒸馏水，调节pH至7.2。向锥形瓶中加入2500U/g混合蛋白酶（中性蛋白酶和胰蛋白酶），酶解温度为40℃，酶解时间为1.5h，在震荡水浴锅中鳕鱼鱼肉进行酶解。准确酶解后立即置于沸水浴中10min至15min，对混合酶进行灭活处理。灭活后取出，室温下放置10min。对酶解液进行离心，收集上清液。3.5.3水解度的测定 采用茚三酮比色法（赵新淮等，1994）测定水解度。（1）标准曲线的绘制 准确称取50mg烘干至恒重的甘氨酸粉末，用蒸馏水溶解并定容至50mL。取2mL上述溶液定容至100mL，即成20ug/mL的甘氨酸溶液，再取上述20ug/mL溶液继续稀释成浓度为2ug/mL、4ug/mL、8ug/mL、12ug/mL、16ug/mL、20ug/mL的溶液。分别取各浓度稀释液2.0mL于试管中，分别加入茚三酮显色剂1.0mL，充分震荡混匀后，于沸水浴中加热15min，结束后立即置于冷水中冷却。冷却后各加入5.0mL预先配好的40%乙醇溶液，剧烈震荡直至溶液棕红色褪去，于室温下放置5-10min。以蒸馏水调零，在570nm下测定吸光值。同时做空白实验，以甘氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制甘氨酸标准曲线。图3-5甘氨酸标准曲线Figure3-5Standardcurveoftheglycine（2）样品水解度的测定 对酶解离心后的上清液进行50倍、100倍、150倍、200倍、250倍的稀释处理。各试管中加入不同倍数稀释液2.0mL，分别加入2.0mL茚三酮显色剂，震荡混匀后，沸水加热15min,并作空白实验。其余步骤同上，测定各浓度样品的吸光值。表3-5样品稀释倍数实验Table3-5Sampledilutionexperiment稀释倍数A1A2平均值选择501.5711.5681.5701000.7800.7790.7801500.5060.5060.5062000.3920.3900.391√2500.3000.3000.300 由上表3-5实验数据显示，当稀释倍数为200倍时，吸光值处在较为合理的范围内。使用标准曲线计算酶解液中的-NH2含量，标准曲线和样品需要同时测定。水解度的计算公式如下[15]： DH=×100%=[]÷htot×100%式中：DH-水解度（%）h-水解后每克蛋白质被酶解释放的肽键毫摩尔数（mmol）-NH2htot-每克蛋白质原料中的肽键毫摩尔数（mmol），胶原蛋白取8.41N-原料中氮含量，取2.58。3.5.4工艺优化试验（1）单因素试验表3-6鱼肉酶解优化工艺参数Table3-6Fishenzymatichydrolysisprocessparameters12345料液比1：21：31：41：51：6加酶量（U/g）15002000250030003500酶解温度（℃）2030405060酶解时间（h）0.511.522.5 采用4因素5水平单因素试验对鳕鱼鱼肉酶解工艺进行优化，以水解度的大小衡量工艺优化的优劣。3.6鳕鱼骨胶原蛋白酶解工艺3.6.1预处理将提取并离心后的胶原蛋白（明胶）上清液进行冷冻干燥处理，冻干后的干样品收集至封口袋并置于干燥器中备用。3.6.2操作步骤称取干样品0.5g，用蒸馏水溶解并定容至50mL，即成1%底物溶液。酶用量的测定采用2000U/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL五种不同的酶量分别处理1%底物样品溶液。实验参数如下：表3-7酶用量实验参数Table3-7Enzymedosageparameters试剂试管号1（空白组）2（原液组）34567样品液(mL)2.02.02.02.02.02.02.0酶量(mL)2.02.02.02.02.02.02.0酶解温度(℃)50酶解时间(h)1.5灭活时间(min)15其中试管3/4/5/6/7分别加入已配好的2000U/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL浓度的酶液，于50℃震荡水浴锅中震荡酶解。准确酶解1.5h后，立即在沸水浴中对酶进行灭活15min。灭活结束后室温下放置5~10min，离心后取上清液。3.6.3水解度的测定 对酶解离心后的上清液进行50倍、100倍、200倍稀释处理。各试管中加入不同倍数稀释液2.0mL，分别加入2.0mL茚三酮显色剂，震荡混匀后，沸水加热15min,并作空白实验。其余步骤同3.6.1（3），测定各浓度样品的吸光值。3.6.4工艺优化试验单因素试验表3-8鱼骨蛋白酶解工艺优化参数Table3-8Fishproteinenzymaticprocessparameteroptimization1234酶解温度(℃)30405060加酶量(U)3000400050006000酶解时间(h)0.511.52 采用3因素4水平单因素试验选取出3个对工艺优化影响较大的因素，然后进行正交试验。以水解度的大小等衡量各因素影响的差异。（2）正交试验 本实验采用的条件是酶解温度、酶量和酶解时间3各因素，进行3因素3水平正交试验。构建试验采用L9_3_4正交表，所得正交试验表如下：表3-9正交试验设计表Table3-9Orthogonaldesigntable实验号123温度（℃）加酶量（U）时间（h）13040001.023050001.533060002.044040001.554050002.064060001.075040002.085050001.095060001.53.7鱼骨钙肽螯合物制备工艺3.7.1操作步骤将鱼骨酶解液进行灭活、离心，取上清液。调节pH至8.5，按胶原蛋白与Ca2+的质量比为2:1的比例加入相应质量的CaCl2。60℃的恒温水浴锅中水浴1.5h。水浴后加入6倍体积的纯乙醇沉淀10min，用滤布作为滤层进行抽滤，抽滤过程中需用纯乙醇清洗。将纱布上的固体转移至离心管中，进行冷冻干燥处理，备用。大致过程如下：鱼骨胶原肽液→加入氯化钙→调整pH值→恒温水浴螯合→浓缩→醇沉→抽滤、洗涤→冷冻干燥制得成品。3.7.2螯合率的测定螯合产物用20.0mL蒸馏水溶解，采用EDTA络合滴定法（GB/T-6436-2002）测定螯合产物的钙含量，由下面公式计算螯合率[16]：螯合物=3.7.3工艺优化试验单因素试验表3-10单因素试验参数Table3-10Singlefactortestparameters因素1234温度（℃）40506070pH5.05.25.45.6肽钙质量比1:12:13:14:1（2）影响螯合率的因素多肽与钙螯合工艺的主要影响因素有许多，一般认为，影响多肽钙螯合物合成工艺的因素包括：反应pH值、多肽液浓度、肽盐质量比、反应温度、反应时间等[9]。高菲、王维有等人为了筛选出影响多肽-钙螯合率的主要因素，应用Mintab16软件进行N=6的Plackett-Burman设计。研究结果显示，pH值和肽盐质量比对螯合率有极显著影响，而温度、时间和多肽浓度对螯合率的影响不显著[10]。3.7.4傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析在红外光照射下，将适量的钙肽螯合物冻干样品和烘干至恒重的光谱纯KBr置于玛瑙研钵中，混匀并研磨成粉末状并压片，后将压片后的样品放入样品室。用Nicolet-200SXV傅里叶变换红外光谱仪对样品在4000-500cm-1区间扫描，设置分辨率为2cm-1。4结果与讨论4.1热水抽提骨胶原蛋白工艺条件研究4.1.1单因素试验及实验数据表4-1Folin-酚法测定蛋白浓度及提取率Table4-1Folin-phenolmethodforproteinconcentrationandextractionrate因素A1(500nm)A2(500nm)提取液体积(mL)蛋白浓×25(ug/mL)提取率(%)料液比1：20.5480.5780.5636012727.27017.551：30.5400.5380.5399012181.81825.201：40.3750.3750.3751208454.54523.321：50.2890.2890.2891506500.00022.411：60.2480.2380.2431805454.54522.57高温软化时间(min)100.4120.4000.406909159.09118.95200.4900.4660.4789010795.45522.34300.5400.5380.5399012181.81825.20400.6460.6510.6499014670.45530.35500.7040.6950.7009015829.54532.75提取时间(h)20.4500.4430.4479010079.54520.8540.5400.5380.5399012181.81825.2060.5200.5240.5229011795.45524.4080.5250.5250.5259011863.63624.55100.5270.5280.5289011920.45524.66提取温度(℃)500.4000.4050.403909079.54518.79600.4740.4400.4579010318.18221.35700.5400.5380.5399012181.81825.20800.4370.4360.437909852.27325.09900.4420.4310.437909852.27325.09表4-2测定羟脯氨酸含量及提取率Table4-2Thedeterminationofhydroxyprolinecontentandextractionrate因素A1(560nm)A2(560nm)提取液体积(mL)羟脯氨酸浓度(ug/100mL)提取率(%)料液比1：20.3820.3810.3815100265.88345.231：30.3880.3920.390150272.77269.601：40.3460.3320.339200231.44378.741：50.2700.2720.271250176.33774.991：60.2090.2080.209300125.68964.14高温软化时间(min)100.2750.2780.277150180.79446.13200.3360.3340.335150228.20158.23300.4130.4190.416150293.84174.98400.4280.4270.428150303.16177.36500.4430.4370.440150313.29079.94提取时间(h)20.3080.3060.307150205.51152.4440.4090.4040.407150286.14373.0260.4050.4130.409150288.16973.5380.4180.4160.417150194.65275.19100.4170.4200.419150195.86775.50提取温度(℃)500.3890.3900.390150272.36669.50600.4040.4140.409150288.16973.53700.4180.4150.417150294.24675.08800.4240.4260.425150301.13576.84900.4250.4230.424150300.32476.63（2）分析与讨论1）料液比对提取率的影响图4-1料液比对提取率的影响Figure4-1Effectofratiooffeedtoliquidonextractionrate合适的料液比会对骨胶原蛋白的提取率产生一定的影响，从图4-1中我们不难看出，料液比1：2时提取率相对较低，而料液比在1：4左右时提取率达到最高。之后随着液体比例的增加，提取率基本呈现下降趋势，而且液体比例的增加意味着提取液的蛋白浓度降低，不利于后续胶原蛋白的离心、浓缩、冻干等操作。高温软化时间对提取率的影响图4-2高温软化时间对提取率的影响Figure4-2Theeffectofhightemperaturesofteningtimeontheextractionrate实验分析了不同高温高压软化时间对提取率的影响变化。从图4-2中看出，高温软化时间在一定范围内与蛋白提取率成正相关，且影响显著，当高温高压软化时间达到50min时提取率达到最大。因此可适当增加高温高压软化的时间以提高骨胶原蛋白的提取。同时也要考虑到高温高压软化步骤的操作周期以及成本等因素，选取适当的高温软化时间。3）提取时间对提取率的影响图4-3提取时间对提取率的影响Figure4-3Effectofextractiontimeonextractionrate实验分析了不同的水浴提取时间对骨胶原蛋白提取率的影响差异，从图4-3中可以看出，在提取时间从2h上升至4h时，蛋白提取率有较少的增加；而在4h之后随着提取时间的增加，提取率基本保持不变。因此，水浴提取时间因素对蛋白提取率的影响较小。4）提取温度对提取率的影响图4-4提取温度对提取率的影响Figure4-4Effectofextractiontemperatureontheextractionrate由图4-4可知，温度在50℃到70℃范围内，随着温度的升高，蛋白的提取率呈上升趋势；在70℃到90℃范围内，蛋白提取率稳定保持不变。最优蛋白提取工艺条件的选择表4-3实验条件参数Table4-3Experimentalconditionparameters编号12基本条件4563料液比1：21：31：41：51：6高温软化时间(min)1020304050水浴提取时间(h)246810水浴提取温度(℃)5060708090以上表进行作图处理如下：图4-5Folin-酚法测定蛋白提取率Figure4-5Folin-phenolmethodforproteinextraction图4-6羟脯氨酸法测定蛋白提取率Figure4-6Determinationoftheextractionrateofproteinhydroxyprolinemethod由图4-5及图4-6中可知，对蛋白提取率影响较大的因素有高温高压软化时间和料液比。当料液比1：4、高温软化时间50min、水浴提取时间4h、提取温度80℃时，提取率最高，达到79.97%。Folin-酚法与羟脯氨酸法比较福林酚法测定蛋白浓度显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品的酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用；并且此方法有蛋白特异性的影响，即不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度不同。本实验中利用福林酚法测定蛋白浓度时，在多次实验排除误差之后发现测定结果明显偏低，分析原因可能是因为测定时反应体系酸碱度以及存在其他物质如巯基化合物、酚类等的原因。羟脯氨酸法测定胶原蛋白浓度具有高效准确的特点，并且因为羟脯氨酸是胶原蛋白中的特征氨基酸，可以通过羟脯氨酸浓度较为准确的反应胶原蛋白提取率，本实验中采取11.1的换算系数，及1mol羟脯氨酸代表11.1mol胶原蛋白。经本实验验证，该方法准确性高，重复性较好，可以作为反应胶原蛋白浓度的检测方法。4.1.2响应面试验数据分析对单因素试验进行直观分析，从中选取料液比、高温高压软化时间和提取温度三个因素，采用3因素3水平的响应面分析方法进行分析。试验因素及水平表如下：表4-4Box-Behnken设计试验因素水平及编码Table4-4TestfactorsandlevelsandcodesinBox-Bchnkencentralcompositedesign自变量水平编码编码水平-101料液比X11：31：41：5高温软化时间（min）X2405060提取温度（℃）X3708090根据Box-Behnken中心组合设计原理，在单因素实验的基础上，以料液比、高温高压软化时间和提取温度三个因素为自变量，以胶原蛋白提取率为响应值R1，进行3因素3水平的响应面分析试验，共17个试验点。其中12个为析因点，5个为中心试验用以用以估算误差。对实验结果中的实验数据进行拟合回归，以料液比（X1）、高温高压软化时间（X2）、提取温度（X3）为自变量，提取率为因变量（响应值），建立二次多元回归方程模型：R1（胶原蛋白提取率）=75.20-2.08X1+8.30X2+3.73X3-0.098X1X2-0.51X1X3-0.36X2X3-4.35X12-18.59X22+4.05X32图4-7残差正太分布图Figure4-7Residualdistributionchart图4-8ResidualsvsPredicted图Figure4-8ResidualsvsPredictedchart表4-5响应面试验方案及结果Table4-5Responsesurfacetestschemeandresults实验编号X1X2(min)X3(℃)提取率(%)110174.9321-1038.903-11065.83400075.66500072.4360-1160.657-10-173.87800076.69901169.871000072.721101-161.391211061.9513-1-1042.38140-1-150.721500078.5116-10180.601710-170.22表4-6回归方程的方差分析Table4-6Analysisofvarianceofregressionequation方差来源自由度平方和均方FP（Pro＞F）显著性X1134.7634.761.990.2012X21551.10551.1031.550.0008**X31111.30111.306.370.0396*X1X210.0390.0390.9638X1X311.031.030.0590.8154X2X310.521.030.0300.8674X12179.4979.494.550.0703X2211455.501455.5083.32＜0.0001**X32168.9068.903.940.0874模型92306.42256.2714.670.0009**残差7122.2817.47失拟395.0831.694.660.0856纯误差427.216.80总和162428.71注：*显著水平为0.05；**极显著水平为0.01。·图4-9料液比、高温高压软化时间、提取温度对提取率影响的三维曲面图Figure4-9Dsurfacemapoftheeffectofmaterialliquidratio,hightemperatureandhighpressuresofteningtimeandextractiontemperature回归方程的方差分析如上表4-6。回归方程中的各变量对响应值的影响显著性由F检验判定，概率值P（Pr＞F）的值越小，则相应变量的显著程度就越高。由表4-6我们可以看出，回归方程达到了极显著水平（p＜0.01），且失拟项不显著（p＞0.05），表明方程相对于实验数据的拟合程度较好。总决定系数R2=0.9497，表明自变量与响应值之间线性关系显著，即该模型预测值与实际试验值拟合较好，因此可利用该回归方程代替试验真实点对结果进行分析。 回归方程各项系数的显著性分析结果显示，因素X2的线性效应和平方效应对蛋白提取率的影响呈现极显著（p＜0.01），因素X3的线性效应对蛋白提取率的影响显著（p＜0.05）。利用Design-export7.0软件在设定的因素水平内对回归方程进行预测，预测最优提取工艺为：料液比1:4提取温度79.46℃，高温处理时间55.68Min，理论最高提取率为82.4216%。在此条件下做三组平行验证实验，最终平均得率为82.35%，与预测相吻合。4.2鱼骨蛋白的SDS电泳图及分析31245图4-10抽提蛋白的SDS电泳图Figure4-10SDSelectrophoresisoftheextractprotein1-maker2、3、4、5-不同浓度的抽提蛋白液图4-10为抽提的鱼骨蛋白液的SDS电泳图谱。电泳结果显示，靠近点样处的颜色较深，距点样处较远的区域颜色较浅。说明抽提蛋白液中的蛋白含量较高；且绝大多数抽提的鱼骨蛋白的分子量较大，从几kDa至几百kDa均有分布；而分子量较小的鱼骨蛋白较少，因此距点样处较远的区域呈现的颜色较浅；同时也说明了热水抽提试验中抽提出的基本上都是鱼骨蛋白，仅有极少量（或几乎没有）的蛋白被水解成多肽。4.3酶活力测定分析表4-7酶活力测定参数及数据Table4-7Parametersanddataforenzymeactivityassay酶的种类作用类型温度（℃）pH酶活（U/g）中性蛋白酶内切407.21.8×105胰蛋白酶复合酶（内切+外切）407.21.7×105木瓜蛋白酶内切406.51.1×104（失活）由于所测蛋白酶中，木瓜蛋白酶已经失活，故采用中性蛋白酶、胰蛋白酶的混合酶作为酶解试验所使用的酶。4.4酶解鱼肉蛋白条件研究4.4.1单因素试验数据及分析表4-8酶解鱼肉蛋白单因素试验数据Table4-8Singlefactortestdataforenzymatichydrolysisoffishprotein料液比1：21：31：41：51：6DH(%)51.6140.6835.5728.4725.33酶量（U/mL）15002000250030003500DH(%)32.9834.6033.9238.0837.87酶解温度（℃）2030405060DH(%)23.7131.3635.5836.6033.75酶解时间(h)0.511.522.5DH(%)26.6028.8635.5835.8735.75料液比对水解度的影响图4-11料液比对水解度的影响Figure4-11Effectoffeedliquidratioonhydrolysisdegre有上图4-11可知，随着料液比的升高，水解度逐渐下降，当料液比在1:6时达到最低，仅为25.33%。水解温度对水解度的影响

图4-12水解温度对水解度的影响Figure4-12Theeffectofhydrolysistemperatureondegreeofhydrolysis水解温度是影响酶解程度的一个重要因素。不同的酶在一定的条件下都具有最适温度范围，温度过高或过低都将使酶活降低，使得水解程度较低。而温度过高会是酶出现不可逆变性，使得水解度很低，同时造成酶的浪费。由图4-12中可以看出，温度从20℃至50℃升高的过程中，水解度是依次增大的；在温度为50℃时，水解度达到最高，为36.60%。温度继续上升时，水解度下降。加酶量对水解度的影响图4-13加酶量对水解度的影响Figure4-13Theeffectoftheamountofenzymeonthedegreeofhydrolysis加酶量的多少直接影响水解度的大小。由图4-13中看出，在酶量1500U/g至2500U/g时，水解度仅有微弱变化；而酶量从2500U/g至3000U/g时，水解度明显增大；之后继续增加酶量，水解度微弱增长。因此，选酶量为3000U/g左右时合适。4）酶解时间对水解度的影响图4-14酶解时间对水解度的影响Figure4-14Theeffectofhydrolysistimeonthedegreeofhydrolysis根据上图4-14看出，酶解时间在0.5h至1.5h时，随着酶解时间的增长，水解度逐渐上升；在1.5h后继续增加酶解时间，水解对基本保持稳定不变。所以选取1.5h左右作为酶解时间较为合适。4.5酶解鱼骨胶原蛋白研究4.5.1单因素试验分析表4-9单因素试验设计及参数Table4-9Singlefactortestdesignandparameter因素水平123（基本条件）4酶解温度（℃）30405060酶量（U/g）3000400050006000时间（h）0.51.01.52.0表4-10酶解鱼骨蛋白试验结果与分析Table4-10Withtheanalysisoftestresultsofframeproteinenzymolysis试验方案试验指标试验编号酶解温度（℃）酶量（U/g）时间（h）水解度（%）11（30）3330.45522（40）3335.97133（50）3338.37344（60）3332.866531（3000）331.417632（4000）335.421733（5000）338.967834（6000）340.0209331（0.5）21.56610332（1.0）27.46711333（1.5）38.82512334（2.0）38.977根据酶解鱼骨蛋白的单因素试验水解度的综合比较，选取温度30℃、40℃50℃，酶量4000U/g、5000U/g、6000U/g，酶解时间1.0h、1.5h、2.0h，三个因素的三个水平进行下面简单的3因素3水平正交试验确定最优组合条件。4.5.2正交试验分析表4-11酶解鱼骨胶原蛋白试验结果与分析Table4-11Withtheanalysisoftestresultsofenzymaticbonecollagen实验方案试验指标试管号ABCA570nm（样品稀释100倍）DH(%)温度(℃)酶量(U)时间(h)12311（30）1（4000）1（1）0.66826.458212（5000）2（1.5）0.76630.647313（6000）3（2）0.87335.17642（40）230.82433.53952310.88435.66562120.72228.77673（50）320.97539.53483130.79631.90193210.81032.539K192.28099.53194.662K297.98098.21498.958K303.97496.492100.617k130.76033.17731.554k232.66032.73832.986k334.65832.16433.539R（极差）3.8981.0131.985因素主→次ACB最优组合条件A3C3B1由正交试验可以看出，当提取温度为50℃、加酶量为4000U/g、提取时间为2h时，鱼骨蛋白的酶解效果最佳。4.5.3酶解后的鱼骨蛋白SDS电泳图谱123456图4-15酶解后的鱼骨蛋白SDS电泳图Figure4-15FishproteinSDSelectrophoresisafterenzymatichydrolysis1-鱼骨