培养基的组成和配制

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陈珊时间：2021.5培养基及其配制工业发酵培养基培养基设计与优化淀粉酸水解工艺淀粉酶水解工艺工业发酵培养基教程地位教学目标学情分析教学重点第一节微生物细胞的化学组成及胞外代谢产物

微生物营养物质的确定主要依据微生物细胞及其代谢产物的化学组成。一、微生物细胞的化学组成细胞化学成分水（70%-90%）干物质有机物(蛋白质、多糖、脂、核酸——占干重96%

维生素、有机酸及它们的降解物）无机物（盐）

细胞含水量=（湿重-干重）/湿重×100%

一、微生物细胞的化学组成

细胞化学元素

主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫（占细胞干重97%）、钾、镁、钙、铁；微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等细胞的化学成分的作用为：遗传连续性、通透性和生化活性。注：微生物细胞的化学组成不是绝对不变的，往往与菌龄、培养条件、环境及生理特性相关。二、微生物胞外代谢产物1、代谢副产物伴随正常代谢作用所产生的一些小分子化合物，包括气体（CO2、H2、CH4）和乙醇、丙酮、丁醇、丙酸、乳酸等低分子质量的醇类、酮类和脂肪酸类。2、中间代谢产物在代谢途径中产生的一些小分子物质，如氨基酸、核苷酸、有机酸和单糖的衍生物，主要用于合成蛋白质，核酸、类脂和多糖等细胞物质。一般不分泌到微生物细胞外，只有在微生物细胞生物合成受阻或外源碳源浓度较高的情况下，才会大量积累和分泌于细胞外。二、微生物胞外代谢产物初级代谢：是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质和能量的过程。这一过程的产物，如糖、氨基酸、脂肪酸、核苷酸以及由这些化合物聚合而成的高分子化合物，如多糖、蛋白质、脂类和核酸等。3、次级代谢产物

次级代谢：次级代谢是指微生物生长到一定时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明显功能的物质的过程，这一过程的产物即次级代谢产物。次级代谢产物大多是一类分子结构比价复杂的含有苯环的化合物，如抗生素、激素、毒素、色素等。二、微生物胞外代谢产物4、胞外水解酶类淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖糖化酶、葡萄糖异构酶等。

次级代谢产物由微生物细胞合成，既不参与细胞的组成，又不是酶的活性基团，也不是细胞的贮存物质。次级代谢产物种类很多，通常有抗生素、激素、毒素、色素等。分泌于微生物细胞外。第二节培养基组成培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的的多种营养物质的混合物。培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖、代谢，产生人们所需产物的营养物质和原料。同时，培养基还应提供微生物生长所必需的环境条件，如一定的pH。培养基的组成和配比是否恰当对微生物的生长、产物的形成、提取工艺的选择、产品的质量和产量都有很大的影响。

工业发酵培养基碳源：供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的基础。氮源：主要构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质、氨基酸等之类的含氮代谢物。功能：构成菌体成分；作为酶的组成分或维持酶的活性；调节渗透压、pH值、氧化还原电位等。无机盐：铅、镁、硫、磷、钾、钠、氯、锌、钴、锰。特殊生长因子：其功能是构成辅酶的组成分，促进生命活动的进行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是极少的。水：营养物质必须溶解于水中，才能透过细胞膜被微生物利用。诱导剂、前体和促进剂：胞外酶合成需要诱导物、有些需要促进剂，抗生素需要前体。工业发酵培养基一、碳源1、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分

提供合成目的产物所必须的碳成分2、来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃3.工业常用的碳源葡萄糖：纯葡萄糖、水解淀粉乳糖：纯乳糖、乳清粉淀粉：大麦、花生粉、燕麦粉、黑麦粉、玉米、野生植物、薯类等蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖糖蜜：糖厂的下脚醋酸、乙醇、亚硫酸纸浆废液、食品工厂的下脚、农作物秸秆等等。糖蜜亚硫酸纸浆3、工业上常用的糖类①葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖但是会引起葡萄糖效应

工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大②糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐②淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低难利用，可以解除葡萄糖效应葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。

例：地衣牙孢杆菌生产α-淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源细胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2如果让你选择其中的碳源，你会选择哪个？为什么呢？思考思考，思考快乐。(半纤维素酶)(1.5g麸皮)不同的碳源对酶生产的影响思考思路嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果：各种碳源相差不大推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型二、氮源

氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。

1、无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之为迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：

满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH毛霉产蛋白酶的研究初始pH的影响:pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大无机氮源的影响：硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素2、有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等

有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。氮源使用的一些相关问题：

有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质

有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：蛋白酶的生产

有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力

开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题三、无机盐的微量元素1、作用：各种不一样2、来源：C、N源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定4、使用注意点A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml

发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，pH对酶活的影响

pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟四、生长因子、前体和产物促进剂、抑制剂

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。1、生长因子

如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。

有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子

自养微生物和某些异样微生物如大肠杆菌不需要外源生长因子也能生长。同种微生物对生长因子的需求也会随着环境条件的变化而改变。如鲁氏毛霉在厌氧条件下生长时需要VB1和生物素（维生素H），而在好氧条件时自身能合成这两种物质，不需要外加这两种生长因子。有时对某些微生物生长所需生长因子的本质还不了解，通常在培养时的培养基中要加入酵母浸膏、牛肉浸膏及动物组织液等天然物质以满足需要。

前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。2、前体青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136作用：前体有助于提高产量和组分用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题例：6000单位/ml的青霉素G，需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间

用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%。前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率什么叫做流加？3、产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。吐温（或聚山梨酯）为非离子型表面活性剂，有异臭，温暖而微苦，系一系列聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯。广泛用作乳化剂和油类物质的增溶剂。聚山梨酯通常被认为是无毒、无刺激性的材料。大豆提取物是植物性化合物的其中一种形式。其分子量及结构都与人体女性荷尔蒙相似，所以也称为植物性雌激素。对于女性荷尔蒙过高者，具有降低危害之影响；对于女性荷尔蒙不足者，又能补充以缓和女性荷尔蒙不足之现象。依据临床研究显示，大豆异黄酮具有多重的健康益处，包括改善更年期症状、改善更年期骨质疏松、降低心血管疾病以及抗氧化等功能。金型洗净剂：能够有效去除油脂和其他工业污渍，能够对机械部件和工厂地板等各种表面发挥卓越的去污力。1.清洗污垢的速度快，溶垢彻底。清洗剂自身对污垢有很强的反应、分散或溶解清除能力，在有限的工期内，可较彻底地除去污垢。2.对金属不会造成的腐蚀.3.清洗过程不在清洗对象表面残留下不溶物，不产生新污溃，不形成新的有害于后续工序的覆盖层，不影响产品的质量。4.清洗过程及现场不会产生泡沫和异味

促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。4、产物抑制剂

在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径活跃，以致可以改变微生物的代谢途径，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。1,6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮丙酮酸乙醛α-磷酸甘油甘油2ATP2ADP葡萄糖2ADP2ATPCO2NAD+NADH+H+NADH+H+NAD+PiH2O亚硫酸氢钠乙醛亚硫酸氢钠加成物五、水

对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。

水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。第三节培养基类型一、根据物理状态划分1、固体培养基(solidmedium)

天然固体基质制成的固体培养基，如马铃薯块、麸皮培养基；二是在液体培养基中添加凝固剂而制成的固体培养基。三是在营养基质上覆盖滤膜制成的滤膜培养基。用于微生物分离、鉴定、计数、测定、保藏等，生产上固体种子培养，某些产品的发酵培养基。

2、半固体培养基(semi-solidmedium)

液体培养基中加入少量的凝固剂而使之呈半固体状态的一类培养基。(0.2～0.7％琼脂)。常用于观察细菌运动特征，噬菌体效价鉴定以及厌氧菌培养等。3、液体培养基(liquidmedium)

不含任何凝固剂，其组分均匀，呈液体状态，用途广泛。常用于微生物生理代谢的各种研究，也是大规模工业发酵生产上普遍采用的培养基。

理想的凝固剂应具备以下条件：①不被微生物液化、分解和利用；②在微生物生长的温度范围内保持固体状态；③凝固点的温度对微生物无害；④不会因高温灭菌而受到破坏；⑤透明度好、凝固力强；⑥配制方便，价格低廉。

琼脂和明胶用作凝固剂的性能比较凝固剂微生物利用程度融化温度凝固点化学本质常用量琼脂绝大多数不利用96℃40-45℃聚半乳糖硫酸酯0.5-2%明胶大多数利用（作氮源）25℃20℃动物蛋白5-12%你觉得实验室中愿意用明胶好还是琼脂好？二、按培养基营养物质的来源划分1、天然培养基(complexmedium)定义：指利用动植物、微生物或其它天然来源的难以确切知道其化学成分的原料所配成的培养基。特点：培养基化学成分复杂，营养丰富，原料来源充足，价格低廉。用途：适宜于实验室和大生产之用。举例：培养酵母和霉菌的麦芽汁培养基属于此类。

实验室常用的天然营养物质2、合成培养基(syntheticmedium)定义：采用已知化学成分的纯试剂所配成的培养基，也称组合培养基(chemicallydefinedmedium)。特点：这类培养基成分明确，重复性强。用途：适用于做分类鉴定，生物测定、选种育种等方面的研究。举例：培养放线菌的高氏一号培养基，培养真菌的查氏培养基。

3、半合成培养基(semi-syntheticmedium)定义：主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基，也称半组合培养基。即在合成培养基中加入某种天然成分而制成的培养基。特点：培养基中部分成分清楚，部分成分不清楚。用途：适合于大多数微生物的培养。大多数培养基都属此类。举例：营养琼脂（NA）中除含有天然的牛肉膏和蛋白胨外，还有成分明确的氯化钠。

三、按培养基的用途划分1、鉴别培养基(differentialmedium)

一类含有某种代谢产物指示剂的培养基。微生物在这类培养基上生长后，分泌的代谢产物与指示剂起反应产生某种明显的特征性变化，根据这种变化将该种微生物与其它微生物区分开来。

伊红-美兰培养基（EMB）：可用于鉴别大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等肠道微生物。大肠杆菌能强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，使菌体表面带H+，染上酸性染料伊红，又因伊红与美兰结合，引起菌落被染上深紫色，反射光下呈绿色金属光泽。伊红-美兰培养基（EMB）

鉴别培养基举例

2、选择培养基(selectivemedium)

根据某类微生物的特殊营养要求或对某种物理化学因子的抗性而设计出来的一类培养基。即根据被分离微生物的特性，采用“投其所好、取其所抗”的原则设计的培养基。

目的：增殖少数手段：“投其所好”混合样品

选择性培养基

成为中劣势菌

优势菌目的：抑制多数菌手段：“取其所抗”选择培养基基础培养基+嗜好营养物基础培养基+抑制剂以纤维素或石蜡油为唯一碳源的选择性培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物。缺乏氮源的选择性培养基可用来分离固氮微生物抑制剂：

青霉素（抑制G+细菌）分离G-细菌抗生素氯霉素，链霉素（抑制细菌）分离酵母菌，霉菌放线菌酮（抑制酵母，霉菌）分离细菌，放线菌

结晶紫：抑制G+

分离G-

染料胆盐：抑制G+

分离G-

孟加拉红：抑制细菌、放线菌分离酵母，霉菌

其它叠氮化钠：抑制霉菌分离乳酸菌

10%酚数滴：抑制细菌，霉菌分离放线菌

用于选择性的物理因素有：温度，氧气，pH值，渗透压等

3、增殖培养基根据某种微生物的营养特性在培养基中加入有利于该微生物生长、繁殖的营养物质，以提高对该微生物的分离效率，加入这些营养物质所构成的培养基就称为增殖培养基。增殖培养基一般营养比较丰富，适合微生物生长的特点，使微生物生长快速、多产且性状典型。4、加富培养基加富培养基是指在普通培养基里加入血、血清、动物（或植物）组织提取液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。加富培养基主要用于培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。四、按培养基用于生产的目的划分

根据培养基用于生产的目的不同，可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基等。1、孢子培养基⑴定义：孢子培养基是以菌种繁殖孢子为目的而设计的培养基，常采用固体培养基。⑵要求：既能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，又不易引起菌种变异。

创造有利于孢子形成的环境条件培养基营养不要太丰富，碳氮不宜过多，特别是有机氮源要低一些无机盐的浓度要适当，否则会影响孢子的颜色和孢子的数量注意pH和湿度

⑶生产上常用的孢子培养基包括麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米琐屑培养基以及用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和NaCl等配制的琼脂斜面培养基。2、种子培养基种子培养基是指供孢子发芽和菌体生长繁殖使用的培养基。这些营养成分应是易被菌体吸收利用的，且比较丰富与完整，其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度以略稀薄为好，以利于菌体的生长繁殖。此外，还要考虑pH。种子培养基的氮源一般采用有机氮源与无机氮源结合，有机氮源中的有些氨基酸能刺激孢子发芽，而无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长。最后一级的种子培养基，其成分要接近发酵培养基。3、发酵培养基发酵培养基是生产中供菌体生长、繁殖和合成产物而设计的培养基。发酵培养基的碳源和氮源要注意速效与迟效的搭配，尽量少用速效营养，多用迟效营养，并要注意调整适当的碳氮比，添加缓冲剂稳定pH。如果微生物生长和产物合成所需要的最佳条件不同，则可以考虑采用补料的方式来满足微生物在不同阶段的需求。发酵培养基的营养物质用量一般较大，在大规模生产时宜采用来源充足、成本低廉的原料，还应有利于下游的分离提取。第四节工业培养基的选择和配置原则

一、工业培养基的选择

选择培养基时应从微生物的营养需求与生产工艺的要求出发，使之满足微生物生长、代谢的要求，达到高产、高质、低成本的目的，其选择的一般原则如下：1、能够满足生产菌生长、代谢的需要2、目的代谢产物的产量最高3、产物得率最高4、生产菌生长及代谢迅速5、减少代谢副产物生成6、价廉并具有稳定的质量7、来源广泛且供应充足8、有利于发酵过程的溶氧与搅拌9、有利于产物的提取和纯化10、废物的综合利用强且处理容易二、培养基的配制原则1、根据微生物的营养需要配制培养基2、营养成分的恰当配比营养物质的浓度适宜；营养物质之间的配比适宜。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。C/N比：培养基所含碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比。高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。例如：发酵生产谷氨酸时：C/N比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；C/N比为3