菌种选育技术

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陈珊时间：2021.5种子的扩大培养工业菌种介绍除常见的四大类典型微生物外，还有病毒，藻类，以及蕈菌类微生物。菌种选育方法自然界筛选，人工诱变，原生质体融合，基因工程技术，蛋白质工程等种子扩大培养种子扩大培养的目的和流程，种子扩大培养的质量影响因素影响种子扩培因素包含的数量，质量等要求优良菌种选育教程地位教学目标学情分析教学重点目前，菌种选育中采用的技术包括：自然选育诱变选育杂交育种原生质体融合技术基因工程技术优良菌种的选育较为定向的育种方法经典的育种方法，有一定盲目性优良菌种的选育

一、自然选育采样增殖培养从自然界分离菌株纯种分离性能鉴定从自发突变中获得菌株

采样

↓增殖培养↓

第一次平板分离→第一次原种斜面↓第二次平板分离→第二次原种斜面↓第三次平板分离→第三次原种斜面

↓第四次平板分离→第四次原种斜面↓初步工艺条件摸索→

复筛种子培养↓较优菌株1－3株保藏及进一步做生产性能试验某些必要试验和或作为育种的出发菌株毒性试验等发酵工业对菌种的要求（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。发酵工业对菌种的要求2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求•为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。•

例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。（二）增殖培养•

尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。（三）培养分离这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。（四）分离发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求（五）毒性试验•自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。二、诱变育种

按照生产的要求，根据生物的遗转和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、而达到菌种选育的目的。发酵工业对菌种的要求

诱变育种一般采用物理、化学诱变因素使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误DNA模板形成异常的遗转信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。发酵工业对菌种的要求原种（出发菌株）纯化斜面培养完全培养基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤单细胞或孢子悬浮液

自然分离（对照液）活菌计数诱变处理诱变处理预备实验

处理液活菌计数平板分离

形态变异并计算其变异率斜面培养

初筛、复筛

自然分离和再复筛保藏及扩大试验诱变育种诱变育种方案设计

出发菌株的选择诱变剂的种类及选择突变株的筛选突变株的发酵试验Q：如何选择出发菌株？自然界分离得到的野生型菌株通过生产选育，即由自发突变经筛选而得到的高产菌株已经诱变过的菌株，有些可以进行多步诱变可以获得高产菌株发酵工业对菌种的要求诱变剂（mutagen）：凡能提高基因突变频率的因素统称为诱变剂诱变剂的种类物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂：辐射和热：转座因子发酵工业对菌种的要求(1)碱基类似物----间接引起置换的诱变剂它们在DNA复制中能掺入DNA分子中，由于其产生异构体的频率高，因此发生的错误配对可引起碱基的置换。

一类与正常碱基结构相似的物质，称为碱基类似物。如：5-BU,8-NG,2-AP等。A-TA-TA-BUA-TG-BUG-CA-BU加入5-BU1.化学诱变剂发酵工业对菌种的要求(2)与碱基起化学反应的诱变剂-----直接引起碱基置换该类诱变剂与碱基起化学反应，改变碱基的结构，导致错配。亚硝酸：G-CA-T转换互变各种烷化剂：G-CA-T互变羟胺：只引起G-CA-T转换（专一性与C起反应）发酵工业对菌种的要求亚硝酸：对碱基的主要作用是氧化脱胺作用（使氨基变为酮基，改变配对性质，引起碱基转换）。

HNO2

AH（次黄嘌呤）ATGCCUGCATGX（黄嘌呤）

不引起突变A-TH-TH-CA-TH-CG-C发酵工业对菌种的要求烷化剂甲基磺酸乙酯（EMS）甲基磺酸甲酯（MMS）硫酸二乙酯（DES）

N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍

(NTG)氮芥、硫芥环氧乙烷NTG：诱变作用强，称为超强诱变剂（突变率1%）；能诱发邻近位置的基因同时发生突变，即所谓并发突变。很多烷化剂除了能诱发点突变外，还能诱发染色体畸变。由于染色体畸变常为辐射所诱发，所以这些物质又称为拟辐射物质。

烷化剂作用的主要机理是引起碱基上某些能形成氢键的集团发生烷基化。烷化位点主要在鸟嘌呤的N‐7位和腺嘌呤的N‐3位上，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。烷化剂的另一作用是使嘌呤整个地从DNA链上脱下来，产生一个缺口，在与缺口相对应的位点上就能配上任何一个碱基，从而引起转换或颠换。发酵工业对菌种的要求(3)移码突变的诱变剂－嵌入诱变剂吖啶类染料（如原黄素，吖叮黄（橙），ICR类等）具有类似碱基对的扁平结构，能插入DNA分子的碱基对之间，使DNA结构变形，导致DNA在复制过程中的滑动，引起DNA链中插入或缺失一个或几个核苷酸，产生移码突变。ICR：一系列烷化剂和吖啶分子相结合的化合物发酵工业对菌种的要求2.物理诱变剂及其诱变机制紫外线，x-射线，γ–射线，快中子，超声波等(1)紫外线（UV）

紫外线是实验室中常用的非电离辐射诱变因子，其作用机制主要是能引起：

DNA链的断裂、

DNA分子双链的交联、嘧啶的水合作用相邻碱基形成嘧啶二聚体（TT，TC,CC）等。

其中最主要的效应是胸腺嘧啶二聚体的形成。胸腺嘧啶二聚体通常出现在同一DNA单链上两个相邻的胸腺嘧啶之间，也可出现在两条DNA单链之间。两种情况导致结果不同。发酵工业对菌种的要求

X‐射线、γ‐射线、快中子等属于电离辐射。以X‐射线为例解释该类诱变剂诱变机理：

X‐射线的诱变作用有直接和间接两种方式：

(1)直接作用是引起DNA双链间氢键的断裂、DNA单链的断裂、不同DNA分子之间的交联等。

(2)间接作用是电离辐射能从水或有机分子中产生自由基，这些自由基作用于DNA分子，引起缺失和损伤。自由基对嘧啶的作用更强烈。此外，X射线还可能使细胞中形成一些碱基类似物，突变由这些碱基类似物所诱发。与紫外线不同的是，电离辐射可通过玻璃和其他物质，穿透力强，能达到生殖细胞，因此常用于动植物的诱变育种。(2)X‐射线、γ‐射线、快中子发酵工业对菌种的要求

短时间的热处理也可诱发突变，热的作用是使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶，从而通过碱基配对错误而引起GC→AT的转换；另外，热也可引起鸟嘌呤‐脱氧核糖键的移动，从而在DNA复制时出现包括两个鸟嘌呤的碱基对，在下一次的DNA复制中该碱基对错配就会引起GC→CG的颠换。(3)热发酵工业对菌种的要求(1).转座因子（transposableelement)定义：位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列。广泛分布于原核和真核细胞中。又称“跳跃基因”(2).转座因子的特点1)在转座时，通过转座因子的复制，可将新形成的拷贝以非同源重组的方式转移到染色体的新部位上；

2)都携带有编码转座酶的基因，该酶具有转移位置的功能，是转座所必需的;3)两端都有正向或反向末端重复序列。

3.生物诱变剂(转座因子)及其诱变机制发酵工业对菌种的要求(4)转座的过程：发酵工业对菌种的要求⑴选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂；②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）；⑵同步培养（生理状态一致）⑶菌龄：对诱变剂最敏感时期营养细胞：对数期孢子或芽孢：萌发前期⑷菌悬液的制备方法物理诱变：生理盐水配制化学诱变：缓冲液配制⑸菌悬液的浓度酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL

细菌，放线菌孢子：108个/mL菌悬液的制备发酵工业对菌种的要求诱变剂的选择要求：高效，简便。主要有两大类：

物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便；化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。(NTG——超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂诱变剂的选择及处理方法目的：克服表型延迟（分离性延迟）。中间培养（CM，培养过夜）发酵工业对菌种的要求突变株的筛选（初筛和复筛）初筛（以量为主）方法需简便、快速（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性（2）根据平板颜色反应直接挑选透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；抑菌圈法（抗生素）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标）复筛（以质为主，定量测定）摇瓶培养法，直接检测所需产物发酵工业对菌种的要求三、杂交育种

杂交育种是指将两个不同性状个体内的遗传基因通过接合、转化、转导等转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，又称基因重组或遗传重组。选择原始亲本诱变筛选直接亲本直接亲本之间亲和力鉴定杂交分离到基本培养基或选择性培养基培养筛选重组体重组体分析鉴定微生物杂交育种的一般程序发酵工业对菌种的要求•

在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。•

大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。•F因子存在于细胞中形式：游离状态(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上(Hfr细胞)。•F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。细菌的杂交发酵工业对菌种的要求

酵母的杂交1.酵母的繁殖•

酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。•

单倍体细胞具α及ε2两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。•

在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。发酵工业对菌种的要求2、酵母杂交•

一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。•

酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。发酵工业对菌种的要求四、原生质体融合

原生质体的制备原生质体的融合融合子的选择实用型菌株的筛选。Q:什么是原生质体？

就是将两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使之形成原生质体，然后在高渗条件下，并加予物理、化学或生物助融条件，使两个亲本的原生质体相互凝集和发生融合的过程。发酵工业对菌种的要求1.标记菌株的筛选：对两亲株要进行标记，以提高筛选率。原生质体的制备：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，制得完整的原生质体。原生质体的融合与再生：两原生质体在促融因子的存在下，发生融合，重建细胞壁，形成新的细胞。融合子的选择：在选择培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而选择融合子。

Q:如何选择生物酶制剂?原生质体融合的步骤发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求五、基因工程育种

基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。发酵工业对菌种的要求一个完整的基因克隆过程应包括：１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外连接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求第二代基因工程

蛋白质工程的实践依据是DNA指导的蛋白质的合成，因此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构符合人们的要求。

蛋白质工程是以蛋白质结构与功能的关系为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新型蛋白质。发酵工业对菌种的要求蛋白质工程内容