核酸的提取制药

生物制药工艺课程核酸的提取制药一、基本概念

核酸类药物包括核酸及其降解产物和衍生物。分两大类：具有天然结构的核酸类物质：多数生物体能自身合成。

这类药物能够改善机体的物质代谢和能量代谢平衡，加速修复受损组织，促使机体恢复正常生理功能。2.自然结构为碱基、核苷、核苷酸类似物或聚合物：通过自然结构的核酸类药物半合成生产。

这类药物是当今治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要药物，也是产生干扰素、免疫抑制剂的临床药物。5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤核酸类药物5-氟尿嘧啶药理作用（作用机制）核酸类药物

核酸分为两大类：脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）RNA与DNA的差异

DNA

RNA糖脱氧核糖核糖碱基AGCTAGCU

不含稀有碱基含稀有碱基98％核中（染色体中）真核线粒体mitochondrialDNA（mDNA）核外叶绿体chloroplastDNA（chDNA）DNA拟核原核核外：质粒（plasmid）病毒：DNA病毒

RNA主要存在于细胞质中，约占90%。核酸的组成1.元素组成：CHONP核酸核苷酸核苷磷酸戊糖碱基嘌呤嘧啶核酸的基本化学组成其中，P元素含量较恒定，为9.1%，即为1g磷酸相当于11g核酸。2.核苷酸组成：核苷酸的基本结构OO（N=A、G、C、T、U）HH(O)H1´2´NOHCH2HH5´4´3´PO-OOO-核糖磷酸碱基DNA的提取与纯化RNA的提取与纯化核酸类药物

一、核酸的两性解离性质

二、核酸的溶解性三、核酸的紫外吸收（λmax=260nm）

四、核酸的鉴定核酸类药物线性大分子（粘度高,抗剪切力差）可用电泳或离子交换（色谱）进行分离。核酸类药物

核酸的结构特点决定了核酸的性质。一、核酸的两性解离性质酸性基团---磷酸基---中强酸碱性基团---氨基，碱基---弱碱DNApI=4~4.5RNApI=2~2.5总结：（1）两性电解质（2）等电点在酸性范围内核酸类药物二、核酸的溶解性DNA和RNA微溶于水.室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA在碱性条件下水解。0.14摩尔法-----DNA蛋白与RNA蛋白的分离方法大多数核酸(RNA与DNA)与蛋白结合组成核蛋白形式存在.两种核酸蛋白在水中的溶解度受盐浓度的影响不相同.DNA蛋白1～2mol/LNacl溶解度大是在水中的2倍0.14mol/LNacl溶解度最小RNA蛋白0.14mol/LNacl溶解度大在实验室中，有用浓盐法制备DNA或RNA，为什么？核酸类药物DNA的紫外吸收光谱天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值1232202402602800.10.20.30.4波长（nm）光吸收123三、核酸的紫外吸收核酸类药物四、核酸的鉴定加热条件下，D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚绿色(RNA)D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺蓝紫色(DNA)核酸类药物一、RNA的提取与制备

工业用RNA的提取（1）RNA及其工业来源：从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体——青霉素的产黄青霉菌体。通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。

在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。（2）高RNA含量酵母菌株的筛选

可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。

稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNA分子量较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90℃保持3－4h破坏酶)。

浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%－8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。（3）RNA的提取实例：

啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH3g的水，20℃以下缓慢搅拌30分钟。用6mol／LHCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol／LHCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNAl.8g（纯度80％）。RNA提取实例：

[提取][中和]HCl[酸化、沉淀]HCl酵母提取液上清液RNA

NaOH、水pH7、离心pH2.5、离心二、DNA的提取与制备

工业用DNA的提取

取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。工业用DNA的提取

[提取][热变性][沉淀]乙醇鱼精提取液上清液纤维状DNA

水、100℃

15min

冷却、离心70%--80%

（无生物活性）

[干燥]

粗品DNA（热变性后无活性）

具有生物活性DNA的制备动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十二烷基磺酸钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制备需在0～3℃操作）。

[提取]

[洗涤3次]5%SDS

动物内脏沉淀沉淀上层液离心、30min（肝、脾）生理盐水生理盐水[再捣碎]

[沉淀][洗涤、干燥][提取]

纤维状DNA

粗品DNA

上清液

离心95%乙醇冷乙醇、丙酮水、5%SDS

[沉淀]

[洗涤、干燥]