酶切回收连接

酶切回收连接第1页，共21页，2023年，2月20日，星期四质粒DNA的酶切第2页，共21页，2023年，2月20日，星期四定义：识别dsDNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶第3页，共21页，2023年，2月20日，星期四Ⅱ类内切酶作用特点能在特殊位点识别和切断dsDNA，识别序列4-6bp，具有回文结构（180度旋转对称结构）HindⅢ产生5'粘性末端AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAA第4页，共21页，2023年，2月20日，星期四SstⅠGAGCTCCTCGAG产生3'粘性末端GAGCTCC

TCGAG粘端切口第5页，共21页，2023年，2月20日，星期四GTCCAGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口第6页，共21页，2023年，2月20日，星期四第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。3、命名：HindⅢ

Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶属

系

株序书写方法：前3个字母斜体第7页，共21页，2023年，2月20日，星期四酶活性单位指在限定条件下（温度、Buffer），1hr消化1ugDNA的酶量称为一个酶单位（unit）。实际工作中，为保证消化完全，1ugDNA的消化需要3-5个单位的酶，反应时间也要适度延长，通常是反应过夜。第8页，共21页，2023年，2月20日，星期四酶切反应系统的设计回收DNA通常酶切10μg实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。酶通常保存在50%的甘油中，使用时甘油浓度必须小于5%，故酶至少稀释10倍。Buffer通常是10×，使用时稀释10倍。总反应体积20-50ul，不足用tdH2O补足。第9页，共21页，2023年，2月20日，星期四DNA的量酶的用量（U/C）酶在50％甘油中，甘油在总体积的浓度要小于5％反应的总体积Buffer的体积水的体积第10页，共21页，2023年，2月20日，星期四质粒DNA15μl（10μg）HindIII(20U/μl)

1.5μl10×缓冲液E3μl三蒸水9μl_____________________________________总体积

30μlXbaI（20U/μl1.5μl加样顺序加样后混匀，短暂离心，使之至管底。第11页，共21页，2023年，2月20日，星期四DNA片段的

分离纯化第12页，共21页，2023年，2月20日，星期四四、操作步骤：关键操作：点样在加样孔正上方，不要进入孔中甚至戳穿孔底加样器一旦按下，就一定保持按住直至加样器离开加样孔，否则会将样品又吸回到tip中，使加样失败第13页，共21页，2023年，2月20日，星期四载体DNA目的基因第14页，共21页，2023年，2月20日，星期四

bp—1534—994—695—515—377—237

ABCM

第15页，共21页，2023年，2月20日，星期四酚抽提法切下含目的DNA的胶块。加入酚，将胶块没过即可。振荡后低温冻结，视温度而定时间。30℃水浴融化，若体积小，可补加TE。振荡器上振荡。12,000rpm离心5min。取上清200μl。第16页，共21页，2023年，2月20日，星期四用200μl的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心12000rpm，5min，取上清）。加20μlNaAc，400μl无水乙醇沉淀DNA，冰冻约30min甚至过夜。12,000rpm离心10min，弃上清。将DNA溶于约30μlTE中。第17页，共21页，2023年，2月20日，星期四DNA片段的连接反应第18页，共21页，2023年，2月20日，星期四

DNA连接酶ligase催化DNA5'磷酸基与3'羟基之间形成磷酸二酯键(ATP)

5'5'3'3'OHPOHPDNA连接酶DNA连接酶第19页，共21页，2023年，2月20日，星期四总体积20μl载体0.1~0.2μg目的基因：载体mol数=1～5：1H2O10×buffer载体目的基因ligase总体积20μlμlμlμl