分子生物学：第八章翻译2

第八章翻译2真核生物翻译起始真核生物肽链合成的起始翻译起始因子eIF-3可与40S亚基结合，阻止40S与60S结合形成无活性核糖体。Met-tRNAi首先与GTP、eIF-2结合形成三元复合物。然后与40S亚基结合，形成43S复合体。eIF-4F、eIF-4B、eIF-4A三种起始因子共同作用下，能够识别mRNA5’帽子结构，并具有螺旋酶活性，能够消除mRNA5’非翻译区（5’untranslatedrigion，5’UTR）的分子内二级结构，维持5’UTR的单链状态。43S复合体与mRNA5’端复合体结合，并从5’端扫描起始密码子，形成48S复合体。43S起始复合物在AUG处正确定位后，在eIF-5的作用下，eIF-2-GTP水解，eIF-2和eIF-3等因子从40S亚基上解离。40S亚基与60S亚基结合，形成80S复合物。mRNA5’端帽子结合复合物:eIF4E和5’端帽子结合eIF4A具有解螺旋酶活性,能够解开mRNA5’端起始15bp中存在的二级结构eIF4B能够激活eIF4A的解螺旋酶活性eIF4G用于连接起始复合物中的其它因子PABP和mRNA3’端polyA结合,能够促进起始复合物的形成PABP能和eIF4G结合,mRNA形成一个环形结构起始密码子的选择（Kozak的扫描模型）

eIF1和eIF1A促进43S复合体从帽子结构处开始沿5’UTR移动，直到找到合适的AUG。合适的AUG并不一定是第一个AUG，因为还需要有正确的上下游序列（5’-CCRCCAUGG-3’）。该序列与rRNA的一段保守序列互补性很强。Met-tRNAi、rRNA和eIF-2在起始密码子的选择上有重要作用。跟原核生物差异之处：Met-tRNAi不甲酰化。寻找AUG依靠扫描，而原核生物靠SD序列。有较多起始因子。5‘帽子和3’尾巴都参与起始复合物形成。ATP水解提供能量，是结合mRNA所必需的。小亚基首先跟氨酰-tRNA结合再跟mRNA结合。第一节肽链合成的延伸和终止肽链合成的延伸进位：新进入的氨酰tRNA结合到70S核糖体的A位点上。成肽：肽键形成，这一过程需要肽酰转移酶。移位：核糖体沿mRNA移动一个密码子的距离。进位氨酰-tRNA与核糖体A位点的结合氨酰-tRNA首先与延伸因子EF-Tu·GTP结合。GTP水解提供能量使氨酰-tRNA进入A位点释放的EF-Tu-GDP在EF-Ts作用下，形成Tu-Ts，同时释放GDP。随后，EF-Ts被GTP取代，形成EF-Tu-GTP，再次用于运转氨酰tRNA。这一过程称为Tu-Ts循环。EF-Ts是一种循环因子，可使失活的EF-Tu·GDP变成为有活性的EF-Tu·GTP。由于EF-Tu只能与起始tRNA之外AA-tRNA结合，所以起始tRNA不会结合到A位点。EF-Tu-GDP+EF-TsEF-Tu-Ts+GDPEF-Tu-Ts+GTPEF-Tu-GTP+EF-Ts成肽由大亚基上肽基转移酶（peptidyltransferase）完成.在形成氨酰-tRNA时能量已经储存，所以，形成肽键无需补充能量。

成肽的缩合反应移位核糖体通过EF-G介导的GTP水解所提供的能量向mRNA模板3’末端移动一个密码子，使两个tRNA完全进入E位和P位(去氨酰－tRNA被挤入E位;肽基-tRNA进入P位)，mRNA上的第三位密码子对应于A位准备开始新一轮肽链延伸。需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子肽链合成的终止与释放当终止密码子UAA、UAG或UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的氨酰-tRNA能与之结合。释放因子RF能识别这些密码子并与之结合，使肽酰转移酶将多肽链转移至H2O分子，而不是氨酰-tRNA，释放新生的肽链和tRNA。释放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽链与核糖体解离。原核生物释放因子（releasefactor）RF1：识别终止密码子UAA和UAGRF2：识别终止密码子UAA和UGARF3：具GTP酶活性，刺激RF1和RF2活性，协助肽链的释放真核细胞释放因子：eRF1能识别三个终止密码子。多核糖体(Polyribosome)生物体内合成蛋白质通常是多个核糖体同时与同一mRNA的不同部位相连，构成多核糖体（polyribosome）。蛋白质合成的抑制剂的作用原理

阻止mRNA与核糖体的结合；阻止AA-tRNA与核糖体的结合；干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读；作为竞争性抑制剂抑制蛋白质的合成.链霉素是一种碱性三糖,可以多种方式抑制原核生物核糖体：能干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致mRNA的错读。若以多聚(U)作模板，则除苯丙氨酸（UUU）外，异亮氨酸（AUU）也会被掺入。链霉素的作用位点在30S亚基上。嘌呤霉素是氨酰-tRNA的结构类似物不需要延伸因子就可以结合在核糖体的A位上，抑制AA-tRNA的进入它所带的氨基也能与生长中的肽链上的羧基反应生成肽键，反应的产物是一条3’羧基端挂了一个嘌呤霉素残基的小肽,肽酰嘌呤霉素随后从核糖体上解离出来。通过提前释放肽链来抑制蛋白质合成的。氯霉素阻止mRNA与核糖体的结合；四环素类阻止AA-tRNA与核糖体的结合；链霉素、新霉素、卡那霉素干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读。青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。干扰素（interferon,IFN）干扰素是真核细胞被病毒感染后，合成和分泌的一种小分子蛋白质。它们本身并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白。第三节蛋白质的转运由于细胞各部分都有特定的蛋白质组分，因此合成的蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。翻译时转运的蛋白质:在合成过程中与内质网膜结合，核糖体是“膜结合”的。合成后，蛋白质进入内质网，经高尔基体后穿出细胞质膜。如果这些蛋白质具有某种信号，则可能驻留在运输途径中的某一环节，也可直接定位于其它细胞器(溶酶体等)。翻译后转运的蛋白质:在细胞质中游离核糖体上合成之后释放入细胞质，其中一些具有线粒体定位信号或核定位信号。蛋白性质运转机制主要类型分泌蛋白质在结合核糖体上合成，并以翻译-转运同步机制运输免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素等细胞器发育蛋白质在游离核糖体上合成，以翻译后转运机制运输核、叶绿体、线粒体、乙醛酸循环体、过氧化物酶体等细胞器中的蛋白质膜的形成两种机制兼有质膜、内质网、类囊体中的蛋白质一、翻译后转运机制

线粒体蛋白质跨膜转运前导肽的作用和性质叶绿体蛋白质的跨膜转运核定位蛋白的转运机制线粒体蛋白质跨膜转运被运转蛋白质大多数以前体形式存在：由成熟蛋白质和位于N端的前导肽（leaderpeptide）组成。是一种需能过程；来自线粒体Hsp70引发的ATP水解和膜电位差。运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与Hsp70或MSF等分子伴侣相结合为待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。前导肽的作用与性质带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较为丰富，分散于不带电荷的氨基酸序列之间；缺少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸(Ser等)含量较高；有形成两亲(既有亲水又有疏水部分)α-螺旋结构的能力。蛋白质在细胞器中的定位－需要多级信号序列线粒体N端前导序列默认将蛋白通过外膜和内膜受体导入基质定位于膜间腔或内膜的蛋白，需要一个附加的信号序列，蛋白质被重新输送到基质以外的其它部位叶绿体蛋白质的跨膜运转叶绿体定位信号肽一般有两个部分：第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质，第二部分决定该蛋白能否进入类囊体。核定位蛋白的运转机制在细胞质中合成的蛋白质核孔复合体细胞核核定位序列（nuclearlocalizationsequence,NLS）为了核蛋白的重复定位，这些蛋白质中的信号肽——被称为核定位序列(NLS-NuclearLocalizationSequence)一般都不被切除。NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白质向核内运输过程需要核运转因子（Importin）α、β和一个低分子量GTP酶（Ran）参与。核孔复合体核孔复合物(nuclearporecomplex

(NPC)):是核膜上一种巨大的蛋白质结构，为细胞质和细胞核之间分子、高分子物的双向运输提供通道8重对称模型:由上环和下环组成（黄色），以8个辐轴(spokes)连接(外侧表示为兰色，内侧表示为绿色)。核定位蛋白跨细胞核膜运转过程示意图Importinα和β组成的异源二聚体是核定位蛋白的可溶性受体，与核定位序列相结合的是α亚基。这些蛋白组成的复合物停靠在核孔处，依靠RanGTP酶水解GTP提供的能量进入细胞核。α和β亚基解离，核蛋白与α亚基解离，α和β分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。二、同步转运机制蛋白质定位信息存在于自身结构中，并通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达,即蛋白质通过其信号序列与膜或其它任何结构结合---信号肽假说的基础。蛋白质跨膜运转信号也是由mRNA编码的。蛋白质通过其N-端的信号肽在内质网中运转到不同的细胞器绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都带有一个信号肽(signalpeptide)，位于蛋白质的氨基末端（13-36个残基）：（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；（2）在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸）。信号识别颗粒(signalrecognitionparticle,

SRP)SRP是一个小的RNA-蛋白质复合体,由约300个核苷酸的7SRNA和6种紧密结合的蛋白质(分子量从9~72KDa)所组成。在翻译过程中它能够识别信号肽，指导核糖体到转运通道。SRP能同时识别新生肽的信号肽，并导致该多肽合成的暂时终止（此时新生肽一般长约70个残基左右）。SRP-信号肽-多核糖体复合物即被引向内质网膜并与SRP的受体——DockingProtein（停靠蛋白，又称SRP受体蛋白）相结合。信号肽假说的建立1972年Milstein等发现IgG轻链前体比成熟的IgN-端多20个aa。Bloble将IgG的mRNA在无细胞系统中，以游离核糖体在体外合成的是IgG前体；若在无细胞系统中加入狗胰细胞的RER，就能产生IgG成熟蛋白。成熟的IgG蛋白和前体蛋白相差20个疏水性aa。加入蛋白水解酶不能使正在合成的IgG水解，而同时加入去垢剂就可以使其水解。（蛋白水解酶只水解游离的蛋白）。用去垢处理骨髓瘤后所获得的多核糖体与膜分离，然后在离体的条件下继续进行新生肽的合成。经短时温育得到的是成熟的IgG，而长时温育得到的是前体IgG，表明mRNA3‘端核糖体上多肽进入RER。基于上述实验：被转运的蛋白的新生肽比成熟的大，分泌性蛋白进入内质网的过程与其生物合成过程是平行进行的，Bloble提出信号肽假说（获得1999年诺贝尔奖）。分泌蛋白N端有一段信号肽新生肽长50—70个氨基酸后，信号肽被RER膜上受体识别。信号肽进入RER内腔后被水解。SRP和DP蛋白介导了蛋白质的跨膜运转过程新生蛋白质通过同步转运途径进入内质网内腔的主要过程，SRP和DP蛋白介导了蛋白质的跨膜运转过程蛋白质降解是一个有序的过程。他们找到了人体细胞控制和调节某种人体蛋白质数量多少的方法。他们发现，人体细胞通过给无用蛋白质“贴标签”的方法，帮助人体将那些被贴上标记的蛋白质进行“废物处理”，使它们自行破裂、自动消亡。泛素调控的蛋白质降解具有重要的生理意义,它不仅能够清除错误蛋白质,对细胞生长周期、DNA复制以及染色体结构都有重要的调控作用，而且对于理解细胞的许多生理过程和新药的开发具有重要的意义。2004年诺贝尔化学奖：阿龙·切哈诺夫（以色列）阿夫拉姆·赫尔什科（以色列)欧文·罗斯（美）原核生物蛋白质降解在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶(称为Lon)来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两个分子ATP。真核生物蛋白质降解：泛素化修饰介导真核蛋白的降解依赖于一个只有76个氨基酸残基、其序列高度保守的泛素(Ubiquitin)。细胞内即将被降解的蛋白首先在ATP的作用下与泛素相连（需要E1,E2,E3三个降解因子的参与），并将该复合体运送到特定的蛋白降解体系中直到完全降解。E1(泛素激活酶)，通过水解ATP，以高能硫醇酯键将自身的一个cys残基和泛素末端的一个Gly残基连接随后泛肽被转移给E2(泛素转移酶)E3(泛素连接酶)，催化泛素和底物蛋白lys上的ε-NH2基团以异肽键连接E1负责激活泛素分子。这种反应需要ATP能量。泛素分子被激活后就被运送到E2上，E2负责把泛素分子绑在需要降