肝受体激动剂抑制nlrp3炎性体活化

肝受体激动剂抑制炎性体活化 吉林大学动物医学学院吉林长吉林大学第一医院，吉林长春受体激动剂对配体诱导小鼠巨噬细胞炎性复合体活化的影响，应用荧光定量方法测定肝Ｘ受体激动剂对ＬＰＳ诱导的ＮＬＲＰ３等表达的影响，并用免疫蛋白印迹的方法检测Ｃ的活化片段。结果证明肝受体激动剂能抑制炎性体的活化。ＬＸＲｓ激动剂的抑制作用，部分源于其抑制ＮＬＲＰ３和ＩＬ１β的转录。肝号 文献标志码 文章编号ｎＨＵ１１，ＤＵ１Ｉ２，ＨＡＮＷｅｎｙｕ１，ＹＡＮＧ＊，ＣＨＥＮ＊ｆｎｔｉｌｎ ｈｙｎｅｎ３ｍＲＮＡｈＳｆ１ｙｙｆｓ ｎ ｄｎ．ｅ*Ｅｗ天然免疫系统是抵御病原微生物和感受危险信号的第一道防线。病原来源的病原相关分子模式或细胞内外源性的损伤因子损伤相关分子模式被胚系编码的模式识别受体识别启动天然免疫反应清除或应激损伤实现宿主防御。主要的模式识别受体包括受体ＡＩＭ２样受体以及Ｃ型凝集素样受体等。收稿日期基金项目国家自然科学基金资助项目教育部新８

样受体在天然免疫系统中的重要作用已经成为近年来人们关注的热点。人ＮＬＲｓ家族蛋白有个成员小鼠有个成员。目前发现ＬＲｓ的ＡＩＭ２参与构成炎性体ａｏ结构。炎性体是胞浆中的多蛋白大分子复合物，由上述识别受体分别与接头蛋白ＡＳＣ和ｏｐ组成而不需要可以直接通过ＣＡＲＤ域间相互作用与形成复合物［２］。炎性体装配后刺激剪切活化为具酶活性的水解ｏＩＬβ促进其剪切成熟并释放到胞外，从而发挥广泛的生物学效应。目前以炎性体研究最为深入已发现多种病原病原成分或产物结晶物质等可以活化炎性体菌［］尼日利亚菌素［］尿酸盐晶体胆固醇晶体［９以细胞释出的ＴＰ［１］氧化的线粒体于炎肿瘤过敏等多种疾病发生发展中起重要作用，调控炎性体活化将成为预防和治疗这些疾病的重要策略。肝Ｘ受体ｒＸ是核受体超家族中的成员能调节胆固醇和脂肪酸代谢。ｓ有α和β两个亚型多种氧化固醇类物质如羟化胆固醇羟化胆固醇等是其天然激动剂和是其合成配体而被广泛用于ｓ功能研究。近年来的研究表明ｓ不仅参与脂质代谢而且在抗、促进凋亡细胞吞噬清除炎症等免疫反应调节中起重要作用ｓ对炎性体信号是否具有调节作用对该问题的阐明不仅有助于拓展炎性体的调控理论知识并将为深入探讨代谢调节与炎性体信号之间交互机制奠定基础。１材料与方法 材 购自公司购自ａ公司

ｎｅｒｘ购自公司Ｒ引物由生工公司合成１ＧＨＲａＣｅβＩＳＡ试剂盒购自公司。提取和ＲＴＰＣＲ将小鼠巨噬细胞系和分别分为以下组空白对照组组ＬＰＳ组和组。利用终浓度为Ｌ的培养６ｈ后，再加入ＬＰＳ培养４ｈ。每个样品重复３次。收集上述各组细胞按试剂说明书提取进行逆转录合成ｃＤＮＡ。取逆转录产物进退火。反应结束后取ＰＣＲ反应产物１０μ进行琼脂糖凝胶电泳。同时将逆转录产物进行ＲｅｅＰＣＲ，以表达量最高的样品分别稀释为ｇ作为标准品ｅ反应过程９５℃３循环４０次。以目的和内参ＧＡＰＤＨ的比值作为相对ｍＲＮＡ浓度进行分析。相关引物及序列见表１。表１引物序列及产物长度上游引物 下游引物产物长度 细胞培养上清蛋白的提取和分析分为以下组空白对照组ＬＰＳ组ＬＰＳ＋ＡＳ＋ＡＴＰ组。的终浓度为Ｌ培养再加入１Ｌ的培养４，最后加入５Ｌ刺激。每个样品重复３次。收集上述细胞培养上清取不同处理组的相同体积培养上清加入相同体积的甲醇再加入／４体积的氯仿离心弃上清加入１Ｌ甲醇再次离心弃上清溶解煮沸分离样品；将蛋白转至ＰＶＤＦ膜上脱脂奶粉室温封闭一

１５Ｌ发光暗室压片显影。试剂盒说明书检测细胞培养上清中总ＩＬ１β的含统计学分析所有资料采用统计分析软件进行处理分析组间比较采用方差分析。Ｐ表示差异显著Ｐ表示差异极显著。２ 在小鼠巨噬细胞系上的表达见图１。用ＬＴ０９０１３１７处理小鼠巨噬细胞７和细胞６ｈ后提取总ＲＮＡ，半定量Ｐ

剂刺激前后表达情况结果７和细胞均表达２种ｓ受体，并且外源激动剂处理后α的表达水平显著上调而的表达水平没有明显变化。因而７和细胞均可用于ｓ受体信号的研究。水平首先以７细胞为研究对象应用半定量ＰＣＰｒｏ见图２Ａ。结果表明能诱导β和ＮＬＲＰ３的转录并且其诱导作用能被抑制。ｏ１表达于７细胞但未见明显调节作用。细胞不表达ＡＳＣ基因并且ＬＰＳ也不能诱导其表达。由于分子在炎性复合物的装配中起重要作用进而以巨噬细胞系为研究对象分析该细胞是否适宜于炎性

体活化和调节结果细胞不仅表达ＡＳＣ，而且ｏ１ＮＬＲＰ３的表达及调节趋势与７细胞类似。为了确证ＬＰＳ和对和 转录的影响应用荧光定量ＰＣＲ进一步分析２种 的表达水平见图。结果表明，达预处理显著抑制ＬＰＳ的诱导作用Ｐβ降低了约倍而降低了约倍７ＲＰ３ｍ水平。空白对照组组处理组处理组。＊＊＜０．０１ｓ激动剂抑制炎性体的活化见配体进行后续研究。ＬＰＳ预处理细胞后外源能明显诱导细胞培养上清中激动剂刺激细胞ｔ方法检测表明细胞培养上清中有ｏ１和其剪切成熟片１的表达。结果表明单独用ＬＰＳ处理并不能诱导１表达联合刺激后可以看到１明显被激活，ＬＸＲｓ明显抑制的活化效应。为了验证的作用同时分析ＬＸＲｓ的另一激动剂的作用应用的方法检测细胞上清中总ＩＬ１β的表达量ＬＸＲｓ激动剂的调节作用与１类似，ＡＴＰ显著促进ＩＬ１β的分泌明显抑制的诱导效应。３适当的炎性体激活有利于宿主防御，但是过度的３反应会多种疾病如痛风、慢性关节炎及多种自身免疫性疾病［］。因此ＮＬ炎性体与免疫平衡密切相关如何调控过度激活的炎性复合体成为本试验关注的重点。ｓ是胆固醇代谢调节信号越来越多的研究表

明１４］ｓ是否是脂质代谢和炎症反应交互影响的桥梁分子，等待人们的深入研究证明。本试验以激动剂对炎性体的影响作为研究切入点为丰富ＮｓＲＰ炎性体之间以及２种信号如何调节代谢与炎症平衡等奠定工作基础。巨噬细胞作为天然免疫反应的重要组成部分，是机体清除病原体的先锋细胞也是炎症反应的主要场所。本研究中和细胞被选为研究用巨噬细胞。ＬＸＲｓ激动剂的信号传递信赖ＬＸＲｓ受体表达２种小鼠巨噬细胞均表达ＬＸＲαＬ而且可以诱导它们表达升高说明蛋白ＡＳＣ和ｏ酶种巨噬细胞是否适宜用于炎性体调节研究有待验证。细胞表达种分子而不表达接头蛋白ＡＳＣ，因此细胞并不适宜用于ＮＬＲＰ３炎性体研究。ＮＬＲＰ３炎性体可被多种因素激活研究选用较多的是ＬＰＳ＋ＡＴＰ经典组合本研究也同样选择通过ｔｔ和显著抑制１的剪切成熟同时抑制了巨噬细胞总ＩＬ１β分泌和产生，并且ＬＸＲｓ的另一激动剂具有相似的抑制ＬＲＰ３炎性体活化通常有２个信号传递第个信号是通过影响ＮＦｋ转录因子活性促进ＮＬＲＰ３炎性体相关分子的表达另一信号是通过影响Ｋ＋离子外流诱导寡聚形成大分子平台［１５］。本研究结果证明ｓ外源激动剂可以显著抑制ＬＰＳ诱导的β的综上所述本试验结果表明活化的ＬＸＲｓ对ＮＬＲＰ３炎性复合体有显著的抑制作用这为探讨肝Ｘ受体调控炎症反应的相关机制提供新的思路也可能为研制抗炎药物提供新的靶标。参考文献ｏｙｃｓｆ