第三节多肽和蛋白质类药物的生产演示文稿

第三节多肽和蛋白质类药物的生产演示文稿目前一页\总数五十一页\编于七点优选第三节多肽和蛋白质类药物的生产目前二页\总数五十一页\编于七点目前三页\总数五十一页\编于七点目前四页\总数五十一页\编于七点1.干扰素概述干扰素的种类干扰素的理化性质干扰素的生物学活性干扰素的临床应用干扰素的生产工艺路线目前五页\总数五十一页\编于七点1.1干扰素的种类概念：（interferon，IFN）干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名称为Interferon，简称IFN。发现：干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。

目前六页\总数五十一页\编于七点天然干扰素分类1.根据来源、基因序列和氨基酸组成分类

I型干扰素：

IFNα、IFNβ、IFNτ、IFN

ω

来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等

功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长

免疫调节(较弱）

其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。

II型干扰素：干扰素γ（IFN)

来源：活化的T细胞和NK细胞产生

功能：免疫调节提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答趋化作用抗病毒和抗肿瘤作用（次要）2.根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。

目前七页\总数五十一页\编于七点上市重组干扰素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ1992年我国第一个基因工程药物IFN-α1b获得国家一类新药证书。研发中的重组干扰素：IFNω，临床阶段目前八页\总数五十一页\编于七点1.2干扰素的理化性质143-166aa；MW:18-40ku；；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纤维膜、琼脂和塑料等介质。目前九页\总数五十一页\编于七点Ⅰ型干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但这种效应不是直接的，而是通过对宿主细胞的作用引起的。①对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体，核内有“抗病毒蛋白”基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻译，并促进病毒mRNA降解。②干扰素能提高细胞表面MHCⅠ类分子的表达水平，受到病毒感染的细胞表面MHCⅠ类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解。③干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。1.3干扰素的生物学活性正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素的作用下才能诱使细胞产生干扰素。广谱抗病毒活性机制目前十页\总数五十一页\编于七点病毒复制抑制病毒复制信号转导IFN-aIFN-诱导蛋白诱导刺激胞核胞核目前十一页\总数五十一页\编于七点抗肿瘤作用机制Ⅰ型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞的有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强

500～1000倍。另外，Ⅱ型干扰素也可通过增强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其抗肿瘤效应。目前十二页\总数五十一页\编于七点免疫调节活性机制

免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子，发挥抗原递呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。目前十三页\总数五十一页\编于七点1.4重组干扰素的临床应用广谱抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）多发性硬化症rhuIFNβ目前十四页\总数五十一页\编于七点1.5.干扰素生产工艺路线（1）体外诱生干扰素制备工艺：

Sendai病毒诱导人白细胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市产量低：1gIFNα，需要3亿ml人血白细胞来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可能性目前十五页\总数五十一页\编于七点干扰素生产工艺路线（2）人源转化细胞系培养生产工艺：

1999年：IFNα-n1/Wellferon,批准用于临床。优点：首次实现大规模商业化生产。缺点：活性低，退出临床应用。目前十六页\总数五十一页\编于七点干扰素生产工艺路线（3）上市产品：重组人干扰素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:目前十七页\总数五十一页\编于七点干扰素生产工艺路线（4）上市产品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；

2002，Rebif(Serono)表达产物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格动物无限细胞系培养生产工艺：目前十八页\总数五十一页\编于七点干扰素生产工艺路线（5）•宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonasputida）•上市产品：IFNα-2b/安福隆•表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性•工艺特点：发酵周期短：几个小时无需变性、复性过程，获得有活性产品纯化过程：淘汰抗体亲和层析基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺目前十九页\总数五十一页\编于七点2.基因工程假单胞杆菌的构建与保藏

基因工程假单胞杆菌菌种建立基因工程假单胞杆菌菌种特性菌种库的建立与保藏目前二十页\总数五十一页\编于七点2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立第一步：干扰素α-2b基因的克隆第二步：表达载体的构建第三步：工程菌的构建目前二十一页\总数五十一页\编于七点第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)

制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因连接质粒,转化E.coli,筛选鉴定克隆。测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。目前二十二页\总数五十一页\编于七点第二步：表达载体构建•IFN基因与表达载体连接•转化大肠杆菌•筛选阳性克隆•获得序列正确表达载体目前二十三页\总数五十一页\编于七点第三步：工程菌构建转化假单胞杆筛选高表达、稳定遗传的工程菌获得原始菌种目前二十四页\总数五十一页\编于七点2.2基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征：细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。菌落：直径2.5-3.0mm，灰绿色半透明状,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR（3）具有生产干扰素能力：放射性免疫学效价不低于2.0×109IU/L。目前二十五页\总数五十一页\编于七点2.3菌种库的建立与保藏•QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性•菌种检查合格后，方可投产。目前二十六页\总数五十一页\编于七点

3.干扰素α-2b的发酵工艺过程目前二十七页\总数五十一页\编于七点3.1摇瓶培养取保存工作种子批菌种，室温融化摇瓶培养：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测：OD值和发酵液杂菌检查。目前二十八页\总数五十一页\编于七点3.2种子罐培养

接种：接入50L种子罐，接种量10%。培养：30℃，pH7.0。控制：级联调节通气量和搅拌转速DO为30%，3～4h，OD>4.0。检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。目前二十九页\总数五十一页\编于七点

3.3发酵罐培养接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。控制：级联调节通气量和搅拌转速。前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。检测：发酵液杂菌检查目前三十页\总数五十一页\编于七点3.4．菌体收集连续流离心机：冷却的发酵液，16000r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。目前三十一页\总数五十一页\编于七点4干扰素的分离纯化工艺过程4.1、干扰素分离工艺过程

4.2、干扰素的纯化工艺过程目前三十二页\总数五十一页\编于七点4.1干扰素α-2b分离工艺过程菌体裂解预处理初级分离目前三十三页\总数五十一页\编于七点(1)菌体裂解

裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保护剂：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）。破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。目前三十四页\总数五十一页\编于七点(2)预处理-沉淀加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。目前三十五页\总数五十一页\编于七点(3)离心

连续流离心机：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121℃、30min蒸汽灭菌,焚烧处理。目前三十六页\总数五十一页\编于七点（4）初级分离

盐析:4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。目前三十七页\总数五十一页\编于七点4.2、干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装目前三十八页\总数五十一页\编于七点(1)溶解粗干扰素

配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45μm滤器和10ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。检查:缓冲液的pH值和电导值。溶解：

2℃～10℃，匀浆，完全溶解。目前三十九页\总数五十一页\编于七点(2)沉淀与疏水层析

等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中

除非疏水性蛋白洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。目前四十页\总数五十一页\编于七点等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40ms/cm，2℃～10℃，静置过夜超滤：1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。透析除盐：调整溶液pH8.0，电导值，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。目前四十一页\总数五十一页\编于七点(3)阴离子交换层析与浓缩0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进行洗脱，配合SDS收集干扰素峰。浓缩：调整溶液和电导，10ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。目前四十二页\总数五十一页\编于七点（4)阳离子交换层析与浓缩用0.1M醋酸缓冲液（pH5.0）平衡树脂。上样，相同缓冲液冲洗。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进行洗脱配合SDS收集干扰素峰。浓缩：10ku超滤膜进行。目前四十三页\总数五十一页\编于七点(5)凝胶过滤层析洗涤液：0.15MNaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂上样，相同缓冲液进行洗脱。合并干扰素部分目前四十四页\总数五十一页\编于七点(6)无