目的基因的分离与克隆演示文稿

目的基因的分离与克隆演示文稿目前一页\总数一百零九页\编于十七点（优选）目的基因的分离与克隆目前二页\总数一百零九页\编于十七点质粒载体噬菌体载体大分子DNA克隆载体基因打靶载体病毒载体第四讲基因克隆的载体与受体用于基因转移的受体菌或细胞目前三页\总数一百零九页\编于十七点基因工程原理纲要第一讲

基因工程概论第二讲基因工程的主要技术第三讲基因工程的酶学基础第四讲基因克隆的载体与受体第五讲目的基因的分离与克隆第六讲克隆基因的检测与鉴定第七讲基因表达调节与产物纯化第八讲从原核到真核基因工程目前四页\总数一百零九页\编于十七点第五讲目的基因的分离与克隆第一节基因组DNA片断化第二节化学合成目的基因第三节目的基因的保存与文库构建第四节目的基因的分离和扩增第五节DNA片段的体外连接第六节重组体导入细菌细胞第七节外源基因导入真核细胞目前五页\总数一百零九页\编于十七点第一节基因组DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切目前六页\总数一百零九页\编于十七点由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene目前七页\总数一百零九页\编于十七点二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则目前八页\总数一百零九页\编于十七点1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）目前九页\总数一百零九页\编于十七点2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。目前十页\总数一百零九页\编于十七点1967年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在Science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节化学合成目的基因目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。（详见第二讲）目前十一页\总数一百零九页\编于十七点将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）第三节目的基因的保存与文库构建目前十二页\总数一百零九页\编于十七点（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为24kbcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb目前十三页\总数一百零九页\编于十七点断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②酶切法：目前十四页\总数一百零九页\编于十七点（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。目前十五页\总数一百零九页\编于十七点各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾目前十六页\总数一百零九页\编于十七点目前十七页\总数一百零九页\编于十七点4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）目前十八页\总数一百零九页\编于十七点例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105目前十九页\总数一百零九页\编于十七点1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文库的构建mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。目前二十页\总数一百零九页\编于十七点（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。目前二十一页\总数一百零九页\编于十七点分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）目前二十二页\总数一百零九页\编于十七点目前二十三页\总数一百零九页\编于十七点反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物目前二十四页\总数一百零九页\编于十七点用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一链3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH碱目前二十五页\总数一百零九页\编于十七点剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’③cDNA第二链合成目前二十六页\总数一百零九页\编于十七点④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’目前二十七页\总数一百零九页\编于十七点目前二十八页\总数一百零九页\编于十七点这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。目前二十九页\总数一百零九页\编于十七点mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物目前三十页\总数一百零九页\编于十七点目前三十一页\总数一百零九页\编于十七点在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶目前三十二页\总数一百零九页\编于十七点目前三十三页\总数一百零九页\编于十七点6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n目前三十四页\总数一百零九页\编于十七点三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析目前三十五页\总数一百零九页\编于十七点第四节目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离1.探针柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。目前三十六页\总数一百零九页\编于十七点纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNATotalmRNA纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA过柱与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特异mRNA洗脱RT-PCR目前三十七页\总数一百零九页\编于十七点2.mRNA消解杂交原理：羟基磷灰石柱结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatitecolumn）目前三十八页\总数一百零九页\编于十七点从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。目前三十九页\总数一百零九页\编于十七点AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白A的cDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱BAPCRcDNA文库目前四十页\总数一百零九页\编于十七点3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端的锚定引物Oligo(dT)引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’3’目前四十一页\总数一百零九页\编于十七点（2）12种锚定引物AGTTTTTTTT5’3’CGTTTTTTTT5’3’GGTTTTTTTT5’3’TGTTTTTTTT5’3’AATTTTTTTT5’3’CATTTTTTTT5’3’GATTTTTTTT5’3’TATTTTTTTT5’3’ACTTTTTTTT5’3’CCTTTTTTTT5’3’GCTTTTTTTT5’3’TCTTTTTTTT5’3’目前四十二页\总数一百零九页\编于十七点（3）5’端的随机引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTT5’3’扩增cDNA第一链。RTNMTTTTTTTT5’cDNA3’NNNNNNNNNN5’3’NNNNNNNNNN5’3’cDNA第二链，并PCR目前四十三页\总数一百零九页\编于十七点（4）随机引物与锚定引物成对扩增12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。引物组合：240组能分出20000多条带！实验结果：如果每条带相当于一种mRNA，20000mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。目前四十四页\总数一百零九页\编于十七点（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。选择有差异的带，进一步PCR作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。目前四十五页\总数一百零九页\编于十七点二、PCR扩增获得目的基因1.直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。目前四十六页\总数一百零九页\编于十七点原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增目前四十七页\总数一百零九页\编于十七点（1）提取基因组totalRNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）根据目的基因序列设计引物2.从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。目前四十八页\总数一百零九页\编于十七点目的基因的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的基因的引物2目的基因cDNA第二链PCRmRNA目前四十九页\总数一百零九页\编于十七点克隆外源基因目前五十页\总数一百零九页\编于十七点外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞基因的重组与转移目前五十一页\总数一百零九页\编于十七点目前五十二页\总数一百零九页\编于十七点一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。第五节DNA片段的体外连接目前五十三页\总数一百零九页\编于十七点1.两段DNA的连接依靠粘性末端目前五十四页\总数一百零九页\编于十七点2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端目前五十五页\总数一百零九页\编于十七点目前五十六页\总数一百零九页\编于十七点ligasenick目前五十七页\总数一百零九页\编于十七点二、齐平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’目前五十八页\总数一百零九页\编于十七点1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补目前五十九页\总数一百零九页\编于十七点④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点目前六十页\总数一百零九页\编于十七点用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用目前六十一页\总数一百零九页\编于十七点

目前六十二页\总数一百零九页\编于十七点

目前六十三页\总数一百零九页\编于十七点④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：目前六十四页\总数一百零九页\编于十七点（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用目前六十五页\总数一百零九页\编于十七点Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接头自我连接目前六十六页\总数一百零九页\编于十七点目前六十七页\总数一百零九页\编于十七点接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接目前六十八页\总数一百零九页\编于十七点5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP处理-OHHO-目前六十九页\总数一百零九页\编于十七点Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。目前七十页\总数一百零九页\编于十七点三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。目前七十一页\总数一百零九页\编于十七点引物1GCAGAATTC

互补序列模板EcoRI位点5’--3’GCAGAATTC

互补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC

互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’3’目前七十二页\总数一百零九页\编于十七点GCTAGCCGG

互补序列模板BamHI位点-5’3-’5’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG

互补序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGG

PCR产物互补序列-5’3’-引物2目前七十三页\总数一百零九页\编于十七点带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’GCTAGCCGG

PCR产物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’GCTAG

PCR产物-5’3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！目前七十四页\总数一百零九页\编于十七点2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！目前七十五页\总数一百零九页\编于十七点AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA目前七十六页\总数一百零九页\编于十七点四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。目前七十七页\总数一百零九页\编于十七点EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。目前七十八页\总数一百零九页\编于十七点2.DNA插入的方向正确用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI目前七十九页\总数一百零九页\编于十七点3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！目前八十页\总数一百零九页\编于十七点4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’3’载体插入片断目前八十一页\总数一百零九页\编于十七点1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）目前八十二页\总数一百零九页\编于十七点目前八十三页\总数一百零九页\编于十七点1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第六节重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备目前八十四页\总数一百零九页\编于十七点使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种目前八十五页\总数一百零九页\编于十七点目前八十六页\总数一百零九页\编于十七点用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理目前八十七页\总数一百零九页\编于十七点4.制备过程培养大肠杆菌OD600至Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬目前八十八页\总数一百零九页\编于十七点二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。目前八十九页\总数一百零九页\编于十七点每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法目前九十页\总数一百零九页\编于十七点10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法目前九十一页\总数一百零九页\编于十七点LB培养受体菌至OD600冰浴15分钟，2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-400

0.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37℃中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法目前九十二页\总数一百零九页\编于十七点4.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜目前九十三页\总数一百零九页\编于十七点环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒5.影响转化率的因素目前九十四页\总数一百零九页\编于十七点①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下。③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化。融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞（competentcells)目前九十五页\总数一百零九页\编于十七点把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。目前九十六页\总数一百零九页\编于十七点cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃-45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的噬菌体但由于