病理学方法研究生3

（优选）病理学方法学年研究生目前一页\总数一百三十七页\编于三点目前二页\总数一百三十七页\编于三点目前三页\总数一百三十七页\编于三点标准盖玻片厚度为0.17mm载玻片厚度是1.1mm载物台与物镜之间的工作距离有限清晰度高物镜最大放大倍数150X主要用于切片的观察正置激光共聚焦显微镜目前四页\总数一百三十七页\编于三点物镜、聚光镜、光源的位置颠倒长工作距离物镜和聚光镜透射光源和载物台之间空间更宽敞清晰度略低于正置物镜最大放大率为60X多用于无色透明的活体观察，如组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验倒置激光共聚焦显微镜目前五页\总数一百三十七页\编于三点工作原理计算机系统激光照射系统显微镜系统检测系统X-Y平台系统Z-轴步进马达目前六页\总数一百三十七页\编于三点激光共聚焦显微镜发展史早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜，1985年WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，1987年，发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。

目前七页\总数一百三十七页\编于三点由于pinhole的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被PMT探测器探测到，从而提高了成像效果。通过对样品在X-Y方向上的逐点扫描，可以形成二维图像。如果调节焦平面在Z线的位置，连续扫描多个不同Z位置的二维图像，则可以形成一个3D图像，3D的重建需要软件的支持。目前八页\总数一百三十七页\编于三点目前九页\总数一百三十七页\编于三点目前十页\总数一百三十七页\编于三点普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜的区别

传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。目前十一页\总数一百三十七页\编于三点

激光共聚焦显微镜与传统显微镜的区别

激光共聚焦显微镜与传统显微镜的区别

1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像

2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片

3.增加侧向分辨率

4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响目前十二页\总数一百三十七页\编于三点普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜的区别目前十三页\总数一百三十七页\编于三点普通的荧光显微镜激光共聚焦显微镜目前十四页\总数一百三十七页\编于三点目前十五页\总数一百三十七页\编于三点**激光共聚焦显微镜的性能特点1.分辨率高最小观察厚度是0.5μm，分辨率是普通光学显微镜的1.4倍2.灵敏度高利用PMT检测荧光3.扫描速度快毫秒级和微妙级4.扫描范围大最大可达2cmX2cm5.图像存取方便6.可进行光切片的观察三维图像分析7.可进行荧光定量分析目前十六页\总数一百三十七页\编于三点激光共聚焦显微镜的应用定量荧光测量

进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。定量共聚焦图像分析

借助于激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。

目前十七页\总数一百三十七页\编于三点3.三维重组分析生物结构

组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。4.动态荧光测定

Ca2+、pH及其它细胞内离子测定，能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。

目前十八页\总数一百三十七页\编于三点5.荧光光漂白恢复（FRAP）--活细胞的动力学参数

荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过激光共聚焦显微镜可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。

6.胞间通讯研究

动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+,PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。

目前十九页\总数一百三十七页\编于三点7.细胞膜流动性测定

ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。

8.笼锁—解笼锁测定

许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。

目前二十页\总数一百三十七页\编于三点9.粘附细胞分选

ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。（2）激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。目前二十一页\总数一百三十七页\编于三点VWFCD31CD31VWFVWFexpressedinbigvessel.CD31expressedinendothelialcellofcapillaryandbigvessel.目前二十二页\总数一百三十七页\编于三点VWFCD34VWFCD34目前二十三页\总数一百三十七页\编于三点WKY40X2SHR-SP40X2GFAPandlectindoublestainingGFAPlectinGFAPlectinGFAPlectinAsweknow,astrocytescomposedtheBBB.Afterstroke,numberofitbecomesmoreandprocessesofitconnectedwithBBBmorecloselythanbefore.GFAP Astrocyte

lectin Vessle目前二十四页\总数一百三十七页\编于三点NG2andlectinindoublestaining

3D3D3DNG2lectinTOTO3目前二十五页\总数一百三十七页\编于三点AMouseModelRed,CD45;Green,DesminandBlue,DAPI目前二十六页\总数一百三十七页\编于三点目前二十七页\总数一百三十七页\编于三点目前二十八页\总数一百三十七页\编于三点目前二十九页\总数一百三十七页\编于三点流式细胞仪

（FlowCytometry,FCM)原理及应用目前三十页\总数一百三十七页\编于三点1、流式细胞仪(FlowCytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。2、流式细胞术(FlowCytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。3.流式细胞术（FlowCytometry,FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。基本概念目前三十一页\总数一百三十七页\编于三点流式细胞术发展简史

1.1934年，Moldavan首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数。2.1953年Crosland–Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。

3.1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。4.1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。5.1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。目前三十二页\总数一百三十七页\编于三点流式细胞仪结构

•激光光源及光束形成系统•流动室及液流驱动系统•光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源，收集不同波长的荧光信号。•信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。•存储、显示、分析系统：计算机。•细胞分选系统目前三十三页\总数一百三十七页\编于三点EPICSXL流式细胞分析仪目前三十四页\总数一百三十七页\编于三点**工作原理

在一定的压力下，鞘液带着细胞或是微粒通过喷嘴中心进入到流式照射室，在流式照射室的分析点，激光照射到细胞发生散射和折射，发射出散射光；同时，细胞所携带的荧光素被激光激发并发射出荧光。前向散射光（FSC)和侧向散射光（SSC)检测器把散射光转换成电信号，荧光则被激光器收集，不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增器，把荧光转换成电信号。散射光信号和荧光信号经过放大后，再经数据化处理输入电脑并储存，根据细胞的散射光和荧光进行分析或分选。目前三十五页\总数一百三十七页\编于三点目前三十六页\总数一百三十七页\编于三点FlowCellInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液体在高压下形成一个圆柱形的液流，样品从液流的中心流入，液体就像一个鞘一样包在样品的外面。流动的鞘液和流动的细胞在喷嘴处汇合，并且在喷嘴处被加速，使细胞精确列队依次通过激光束。在喷嘴处细胞进入鞘液并且一直保持在中心位置，这个技术被称为流体动力聚焦。流体动力聚焦使细胞限制并保持在液流的中心。样品在液流中心的流动称之为轴流。目前三十七页\总数一百三十七页\编于三点ForwardAngleLightScatter前向散射光（FSC)FALSSensorLaser透镜安装在分析点周围，用于收集细胞被照射时出现的光信号，信号传想光电二极管或光电倍增器，光电管再把接收的信号转换成电脉冲，电脉冲的强度与光强度成正比。FSC反映细胞的大小与体积。前向散射角传感器目前三十八页\总数一百三十七页\编于三点90DegreeLightScatter（sidescatter,SSC)直角光散射（侧向散射光）FALSSensor90LSSensorLaser在照射点的侧向（90度）有一个光电二极管接收细胞散射的光信号，细胞表面越粗糙、越不规则或内部的颗粒越多，散射到侧向的光信号越大。SSC的强度与细胞的表面结构和内部结构及其大小和形状有关，也成为粒度信号或直角光散射信号。侧向散射角传感器目前三十九页\总数一百三十七页\编于三点LaserFluorescenceDetectors（荧光检测器）FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)光电倍增管（PMT)可以用来检测从细胞发出的不同颜色的荧光信号。细胞荧光包括自身的荧光和荧光素发出的不同颜色的荧光信号。PMT只接收一定波长的荧光，为了PMT只检测一个波长的光，一般在PMT之前安装双色反光镜和不同颜色的滤光片。目前四十页\总数一百三十七页\编于三点StandardLongPassFilters

长通滤光片TransmittedLightLightSource520nmLongPassFilter>520nmLightTransmittedLightLightSource575nmShortPassFilter<575nmLightStandardShortPassFilters短通滤光片目前四十一页\总数一百三十七页\编于三点StandardBandPassFilter（带通滤波器）TransmittedLightWhiteLightSource630nmBandPassFilter620-640nmLight目前四十二页\总数一百三十七页\编于三点DichroicFilter/Mirrorat45deg（双色反光镜）直角形信号检测系统ReflectedlightTransmittedLightLightSource双色反光镜是通过反射一定波长范围的光，透过其余光来实现分离作用的。短通反光镜-605nm短通反光镜（605DSP)允许短于605nm的光透过，长于的被反射。长通反光镜-605nm长通反光镜（605DLP)允许长于605nm的光透过，短于的被反射目前四十三页\总数一百三十七页\编于三点

流式细胞术常用荧光素

流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长（如氩离子气体激光管,它的发射光波488nm,氦氖离子气体激光管发射光波长633nm）。488nm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是：

激发光波长（nm）发射光峰值（nm）

FITC488525（绿）

PE488575（橙红）

PI488630（橙红）

ECD488610（红）

CY5488675（深红）

PreCP488675（深红）

目前四十四页\总数一百三十七页\编于三点目前四十五页\总数一百三十七页\编于三点FL3(PE-TXRed)FL5(PE-Cy7)FL2(PE)FL1(FITC)SSCFL4(PE-Cy5)630/30488/10670/30740LP530/40580/30通道1荧光和SSC650DSP718DSP605DSP555DLP505DSP直角形信号检测系统示意图510~550nm带通滤光片565~595nm长通滤光片>740nm665~685nm605~650nm525575目前四十六页\总数一百三十七页\编于三点FCM的主要测定指标FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性目前四十七页\总数一百三十七页\编于三点外周全血细胞散射光双参数点图目前四十八页\总数一百三十七页\编于三点FCM标记方法单标：一种单抗/tube:FL1,FSC,SSC（三参数）双标：（两种单抗/tube）：FL1,FL2,FSC,SSC（四参数）三/四标：（三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4,FSC,SSC目前四十九页\总数一百三十七页\编于三点

PE最强，适用于弱表达抗原

FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广

biotin-avidin不适合弱抗原的检测抗体的选择目前五十页\总数一百三十七页\编于三点散点图密度图二维等高图直方图图报告中常见的几种流式细胞图目前五十一页\总数一百三十七页\编于三点Dotplot目前五十二页\总数一百三十七页\编于三点细胞分选1.液滴形成液滴沿着一个轴振动，液流会断开形成液滴2.延迟时间当细胞从振动的喷嘴流出到分析点时被激光照射，同时被检测器检测。在分析点下方，液流流出一定的距离才开始断开形成单个的液滴，细胞包含在某些液滴的内部。流式细胞仪在液滴的断点对含有目标细胞的液滴充电。分析点和充电点不在同一时间，存在时间差，这就是延迟时间。流式分选的重要技巧是只给含有目标细胞的液滴进行充电。3.液滴充电和偏转在液滴的断点处，对含有目标细胞的液滴进行充电，使其带上正或负电荷，在液流的两侧放置偏转电极板，不同正负电荷的液滴分别偏向两侧，最后落到收集容器中。现在可以四路的分选。4.液滴的收集目前五十三页\总数一百三十七页\编于三点488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSorting(细胞分选）ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector+85v+190v-85v-190v废液目前五十四页\总数一百三十七页\编于三点流式细胞术的科研应用分析群体细胞所需时间短多参数分析定性或定量目前五十五页\总数一百三十七页\编于三点流式应用常见范围细胞大小细胞的颗粒度细胞表面分子：CD系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡目前五十六页\总数一百三十七页\编于三点流式细胞仪标本的制备一、新鲜实体瘤单细胞悬液的制备（一）酶消化法（二）机械法：剪碎法、网搓法、研磨法（三）化学法：作用原理除去细胞之间起到粘连的镁离子和钙离子，而使细胞分散开来一般用EDTA胰酶消化液。（四）低渗法利用低渗的原理使细胞膜破裂，细胞核逸出称为分散的单细胞核的悬液。该法适用于由新鲜的实体瘤组织直接脱核做核酸染色、DNA倍体和细胞周期分析。避免脱核时间过长而并没有用乙醇固定，则易造成核膨胀或破裂。目前五十七页\总数一百三十七页\编于三点（一）酶消化法

0.5%pH1.5胃蛋白酶、0.25%胰蛋白酶、0.05%胶原酶主要是水解组织间的胶原纤维和多糖物质、分开细胞间的紧密连接。1.切除的组织应马上放入预冷的组织培养液或生理盐水中，清洗血迹及其他污染物2.除去的组织块上的坏死成分、纤维、脂肪以及血管等组织3.将组织块剪成约1cm大小的小块，用冷的生理盐水洗去剪碎的细胞碎片4.一般来说取1.0g组织加入适当的酶消化液10ml5.37℃的恒温水箱消化20-30min，消化期间要振荡或吹打用冷的培养液终止消化，收集单细胞悬液先后用200目和350目的尼龙网过滤除去凝聚的细胞团块，收集细胞并计数、收集细胞一般不小于106细胞用乙醇固定，留用。目前五十八页\总数一百三十七页\编于三点（二）机械法：剪碎法、网搓法、研磨法

使细胞由紧密联结的组织中释放出来，这种方法的缺点是对细胞的损伤比较大，导致细胞碎片多和细胞团块多，影响流式细胞仪的测试的准确性和精密度，当样本中的细胞碎片超过20%时测试的误差就很大。目前五十九页\总数一百三十七页\编于三点（三）化学法

作用原理除去细胞之间起到粘连的镁离子和钙离子，而使细胞分散开来一般用EDTA胰酶消化液。1.将组织剪成小块放入试管2.先加入EDTA液5ml，室温下半个小时弃去。3.加入EDTA胰酶消化液5~10ml，37℃水浴中30min，间断振荡3-5次4.加入350目尼龙网进行过滤，离心沉淀1000rpm，5min，生理盐水冲洗2-3次，离心800rpm5-8min。5.收集细胞悬液再离心弃上清，管底细胞打匀吸入吸管内，总体积，用70%乙醇进行固定，放置4℃冰箱待检。目前六十页\总数一百三十七页\编于三点二、新鲜实体瘤单细胞核悬液的制备：用于细胞核内的成分分析，特别是做DNA定量核细胞周期检测时测定方便实用。三、石蜡包埋组织单细胞悬液的制备可用于既往实验材料的回顾性研究原理：将石蜡包埋组织经二甲苯脱蜡，采用梯度酒精到水，使组织逐渐分级水化，使组织恢复到甲醛固定前的状态，应用相应的酶消化液、解聚组织细胞间的联结物并使细胞从组织片中释放而制成单细胞悬液。目前六十一页\总数一百三十七页\编于三点四、其他单细胞悬液的制备（一）血单细胞悬液的制备用淋巴细胞分离液分离血中的单个核细胞。（二）细胞培养液中的单细胞悬液的制备EDTA胰酶进行消化（三）胸腹水标本单细胞悬液的制备离心洗涤，如果胸腹水中蛋白浓度过高的话，加入肝素抗凝。（四）膀胱灌洗液单细胞悬液的制备膀胱癌细胞，不从尿液中收集，尿液中细胞容易死亡和变性。（五）细针穿刺物单细胞悬液的制备与新鲜实体瘤组织细胞制备相同（六）脱落细胞样品中单细胞悬液的制备食道拉网法，胃镜。支气管镜目前六十二页\总数一百三十七页\编于三点流式细胞仪的应用（一）①细胞生物学：细胞凋亡研究；定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。

②肿瘤学：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。

③免疫学：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。

目前六十三页\总数一百三十七页\编于三点流式细胞仪的应用（二）④血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。⑤药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等目前六十四页\总数一百三十七页\编于三点细胞荧光染色定量技术一、细胞内抗原定量技术（一）原理二抗上带有荧光标记。用标记已知数量的荧光素分子的标准微球作参照，可以计算出每个细胞抗原决定簇的数量（二）方法1.首先设立标准化的荧光素标记抗体2.设定好流式的各种参数，保持不变3.测定标准化的荧光素的强度，做出荧光分子数与荧光强度之间的标准曲线4.测定待测细胞上的荧光强度5.根据荧光强度计算出每个细胞的荧光素的分子数。流式细胞仪应用举例1目前六十五页\总数一百三十七页\编于三点（三）测定的意义1.PCNA及Ki67核抗原的测定2.C-erb-2抗凋亡基因测定3.Myc基因家族4.P535.检测特征性的标记物6.测定细胞内巨细胞病毒目前六十六页\总数一百三十七页\编于三点二.DNA定量技术（一）DNA定量方法1.DNA荧光染料定量法根据荧光染料如PI、EB等对细胞核DNA的亲和能力，使其染色，用流式细胞仪分析细胞中DNA的含量。与DNA结合的荧光染料越多，荧光强度愈强。DNA含量增多证实有肿瘤细胞出现。如果发现异倍体细胞即为恶性肿瘤2.溴化乙啶嘧啶核苷定量法3.吖啶橙定量法（二）对临床肿瘤的指导意义软组织肿瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌。（三）对癌前病变DNA倍体分析细胞不典型增生的程度愈明显，则DNA异倍体出现率也增高。（四）在肿瘤治疗中的作用肿瘤存在异质性，同一种肿瘤细胞对同一化疗药物也可能存在不同程度的反应。通过对DNA含量、S期比率分析，有助于对化疗药物的选择或放射线有效照射量及时间的决定。目前六十七页\总数一百三十七页\编于三点**细胞凋亡检测技术检测凋亡的方法（一）形态学检测FS↓,SS↑,反映了细胞体积缩小，胞核和细胞质结构变化，但是不可以对凋亡细胞进行定量。流式细胞仪应用举例2目前六十八页\总数一百三十七页\编于三点（二）根据细胞膜通透性的染色法

凋亡细胞膜透性有一定程度的增加，染料Hoechst33342透性增加，PI透性不增加可以用来区分活细胞、凋亡细胞和死细胞。Hoechst33342/PI双染色法：低蓝色/低红光正常细胞高蓝光/低红光凋亡细胞低蓝光/高红光死亡细胞目前六十九页\总数一百三十七页\编于三点（三）凋亡细胞的TUNEL和ISNT法1.直接标记法DNA断点测定：3羟基末端，DNA聚合酶-1催化的原位缺口转移法，缺口标记的是生物素化的脱氧三磷酸尿苷或地高辛配体脱氧三磷酸尿苷；后者标记的为FITC-dUTP.2.间接标记法、用链霉素亲和素-FITC或抗地高辛-FITC，使其灵敏度高。无法区分死细胞。目前七十页\总数一百三十七页\编于三点流式“TUNEL”脱氧核苷酸转移酶催化FITC-dUTP和3’OH末端结合，DNA破裂的断端被FITC-dUTP结合。目前七十一页\总数一百三十七页\编于三点（四）用荧光染料对降解的DNA进行测定

细胞凋亡后，DNA断裂，DNA断裂生成的小片段易于释放到细胞外，导致细胞内的DNA含量减少。用亲DNA的染料PI对固定后的细胞进行染色，经流式细胞仪分析凋亡细胞位于正常细胞的G0/G1期峰之前出现凋亡细胞峰。不能检测早期凋亡细胞。细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞

Sub-G0/G1peaksPIstaining目前七十二页\总数一百三十七页\编于三点（五）FITC-AnnexinV/PI双染色法细胞凋亡早期是膜表面的磷脂酰丝氨酸（PS)从细胞膜内转移到膜外，因此细胞膜上磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在膜外。AnnexinV是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，易与PS结合，由此充当了检测PS的探针。目前七十三页\总数一百三十七页\编于三点图AnnexinV/PI双标记分析细胞凋亡和坏死目前七十四页\总数一百三十七页\编于三点

细胞在FAS单克隆抗体的刺激下，可以产生早期的凋亡。目前七十五页\总数一百三十七页\编于三点细胞增殖周期测定和DNA倍体分析流式细胞仪应用举例3目前七十六页\总数一百三十七页\编于三点S期是DNA合成期，在S期内，DNA进行复制，使细胞的DNA含量由2倍体变为4倍体。G1和G2期为DNA合成前、后间期，此期无DNA的合成，但RNA和蛋白质进行合成。M期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞。细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染色体。在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C。M期以后部分细胞进入G1期，继续进行增殖，部分细胞进入G0期，即静止期，不再继续增殖。因此，FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周期时，将DNA含量直方图分为三部分，G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正态分布。DNA细胞周期分析细胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量细胞数量2N4N

目前七十七页\总数一百三十七页\编于三点图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图NormalCellCycle

目前七十八页\总数一百三十七页\编于三点2004006008001000PIFluorescenceDNAAnalysisAneuploidpeakDNAindex1.213002251507502004006008001000目前七十九页\总数一百三十七页\编于三点2倍体异倍体4倍体肿瘤组织中的各种DNA倍体目前八十页\总数一百三十七页\编于三点免疫功能的检测（1）利用多参数流式细胞术，对PB中淋巴细胞比例，及淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例，及T细胞亚群进行检测。如CD3+（总T细胞）；CD19+（总B细胞），CD3-/（CD16+5（NK细胞）。3+/CD4+（Th/Ti）：辅助/诱导；CD3+/CD4+/CD5RA+：naïve辅助/诱导T细胞；CD3+/CD4+/CD45R0+：记忆性辅助/诱导T细胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/杀伤；CD3+/CD8/45RA+：naïve抑制/杀伤T细胞；CD3+/CD8+/CD45R0+：记忆性抑制/杀伤T细胞。胞内细胞因子的检测：CD4+/IL-4+，Th1细胞，CD4+/IFN-γ+。（2）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。流式细胞仪应用举例4目前八十一页\总数一百三十七页\编于三点FCM在血液学中的应用1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋巴瘤的诊断，国际上提出MIC分型，即通过形态（M）、免疫分型（I）、细胞遗传学（C）检测，对白血病和淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检测项目之一。现在多应用多参数的流式细胞术，不同抗体分别被几种荧光素标记：第一荧光（FL1）：FITC（异硫氰酸荧光素，Fluoresceinisothiocyanate），FL2：PE（藻红蛋白，Phycoerythrin）FL3：PerCP（多甲藻黄素叶绿素蛋白，peridininchlorophyllprotein），FL4：APC（别藻兰蛋白allophycocyanin,）流式细胞仪应用举例5目前八十二页\总数一百三十七页\编于三点2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞或WBC上出现CD55或/和CD59的减少，可诊断为PNH。5）网织红细胞计数6）白细胞分类计数目前八十三页\总数一百三十七页\编于三点PNH红细胞表面CD59表达目前八十四页\总数一百三十七页\编于三点细胞分选FCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测细胞的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以上。除细胞分选外还可进行染色体分选。分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可用于基因诊断。目前八十五页\总数一百三十七页\编于三点Westernblot实验技术

目前八十六页\总数一百三十七页\编于三点定义印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法目前八十七页\总数一百三十七页\编于三点WesternBlot基本原理

在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。目前八十八页\总数一百三十七页\编于三点WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色目前八十九页\总数一百三十七页\编于三点通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。

细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40（RIPAbuffer)，0.05%PMSF(蛋白酶抑制剂），2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin（亮肽素，溶酶体蛋白酶抑制剂），pH8.0

有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的制备目前九十页\总数一百三十七页\编于三点**蛋白样品的定量常用的蛋白测定方法一、Bradford法

考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。目前九十一页\总数一百三十七页\编于三点二、BCA法蛋白浓度测定

（一）特点：灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl。在50-2000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系。2.BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的TritonX-100，5%的Tween20,60,80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。

BCA蛋白定量目前九十二页\总数一百三十七页\编于三点（二）实验步骤：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2.完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。3.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl。4.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μl。5.各孔加入200μlBCA工作液，37℃放置30分钟。6.测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。BCA法蛋白浓度测定BCA蛋白定量目前九十三页\总数一百三十七页\编于三点0mg/ml00.00227mg/ml0.0320.00454mg/ml0.0640.00909mg/ml0.1230.01818mg/ml0.2190.02727mg/ml0.3050.03626mg/ml0.3770.04545mg/ml0.4432h4h6hhepg222150.3280.3490.5370.5510.8786.4736.78579.58339.79214.65774倍稀释25.89227.142838.333239.16858.6308标准品：0,1,2,4,8,12,16,20μlBCA蛋白定量目前九十四页\总数一百三十七页\编于三点SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链。当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用。大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位)，而蛋白质结合固定比例之SDS後，由於SDS带强负价使蛋白质原先的带电价微不足道，且每单位重量之蛋白质带电价一致，所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。目前九十五页\总数一百三十七页\编于三点丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份目前九十六页\总数一百三十七页\编于三点凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212目前九十七页\总数一百三十七页\编于三点目前九十八页\总数一百三十七页\编于三点目前九十九页\总数一百三十七页\编于三点目前一百页\总数一百三十七页\编于三点转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：480µg/cm2；硝酸纤维素膜：80µg/cm2）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度目前一百零一页\总数一百三十七页\编于三点转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。

目前一百零二页\总数一百三十七页\编于三点转膜后检测丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。目前一百零三页\总数一百三十七页\编于三点封闭脱脂奶粉（5％）BSAWesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）目前一百零四页\总数一百三十七页\编于三点一抗、二抗孵育把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4℃过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37℃一小时，4℃过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。目前一百零五页\总数一百三十七页\编于三点二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)目前一百零六页\总数一百三十七页\编于三点碱性磷酸酶法（AP）NBT(四唑氮蓝)BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。

目前一百零七页\总数一百三十七页\编于三点辣根过氧化物酶法（HRP）化学发光显色法(HRP)Luminol(氨基苯二酰肼)鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物,也可用作过氧化物酶的底物.在Ecl底物中,含有H2O2和鲁米诺,在HRP(辣根过氧化物酶)的作用下,发出荧光来.

DAB(3,3二氨基联苯胺)和HRP反应产生棕色的不溶终产物.

目前一百零八页\总数一百三十七页\编于三点WesternBlot常见问题分析目前一百零九页\总数一百三十七页\编于三点SDS电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐目前一百一十页\总数一百三十七页\编于三点条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适目前一百一十一页\总数一百三十七页\编于三点转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温目前一百一十二页\总数一百三十七页\编于三点背景太高膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高

原因对策转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度目前一百一十三页\总数一百三十七页\编于三点目前一百一十四页\总数一百三十七页\编于三点目前一百一十五页\总数一百三十七页\编于三点激光显微切割技术（lasercapturemicrodissection,LCM）DepartmentofPathologyinHarbinMedicalUniversityZhang,Lei2008-10-15目前一百一十六页\总数一百三十七页\编于三点概述

**显微切割术在显微状态下或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。是90年度初发展起来的一门新技术，它能够从组织切片和细胞涂片上的任一区域切割下十几个、几百个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有关分子生物学方面的研究，如PCR,PCR-SSCP及比较基因组杂交等。目前一百一十七页\总数一百三十七页\编于三点

显微切割的特点一、细微二、原位三、同质四、结合

LCM技术与传统的整个组织或混合细胞的研究相比，所取得的细胞具有可定量和“纯净”的优点，可以集中分析专一细胞类型的遗传分子，同时对未分离的组织可保持其完整性和形态特点，所以，增加了研究的敏感性和准确性。目前一百一十八页\总数一百三十七页\编于三点LCM的原理利用激光束和一种特殊转移膜在组织切片中获取目的细胞，使目的细胞与所有其它非目的细胞和污染细胞分离。转移膜事先放在组织切片含有目的细胞的表面，在LCM显微镜下透过转移膜观察并选择目的细胞。利用脉冲激光束精确地激活紧贴目的细胞上方的转移膜区域，使该区域瞬间熔化并与其下方目的细胞结合，当移去转移膜时，只有目的细胞被取出，使得其与其它细胞分离。目前一百一十九页\总数一百三十七页\编于三点