第六章化学检测

第六章化学检测第1页，共27页，2023年，2月20日，星期三一糖类的化学检测糖类包括多糖、双糖、单糖单糖和某些双糖具有游离羰基——还原糖多糖和蔗糖等无还原性——非还原糖糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。非还原糖必须转化为还原糖再进行测定第2页，共27页，2023年，2月20日，星期三最常用的试剂：斐林（Fehling）试剂基本组成：A：CuSO4溶液B:NaOH和酒石酸钾钠溶液使用时A、B等体积混合(生成酒石酸钾钠铜）酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定。第3页，共27页，2023年，2月20日，星期三定糖常用方法1兰——爱农（Lane-Eynon）法次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、置换法、直接滴定法反应终点用次甲基蓝指示剂显示（还原糖滴定斐林试剂，由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1D还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失）多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定如淀粉，可用酸解或酶解第4页，共27页，2023年，2月20日，星期三操作要点（1）斐林试剂的标定（a）标定预备试验A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V1mL。（b）标定A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V0第5页，共27页，2023年，2月20日，星期三(2)定糖（a）定糖预备试验A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V2mL。（b）定糖A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V第6页，共27页，2023年，2月20日，星期三(3)计算还原糖含量（以葡萄糖计）＝（V0-V)×c×(1/10)×n注意：（a）AB分开储存，防止Cu++变化，临用混合（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净（c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响（d）煮沸时间要一致（e）注意指示剂加入时间和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.5～1mL，1min内完成）（g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热

第7页，共27页，2023年，2月20日，星期三斐林试剂快速法：在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰－爱农法更为明显。第8页，共27页，2023年，2月20日，星期三2碘量法I2→NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应操作要点：（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。（2）标准碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘第9页，共27页，2023年，2月20日，星期三碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液＋15mL0.1mol/LNaOH＋5mL空白液，摇匀后暗反应15min＋1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5％淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录V0(4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液，V1(5)计算：醛糖含量＝（V0－V1）C×M×n注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）第10页，共27页，2023年，2月20日，星期三3铜试剂法将还原糖与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。（1）铜试剂的配制主要提供二价铜离子及碘（2）标准曲线的制作第11页，共27页，2023年，2月20日，星期三（a)标准葡萄糖液的配制0.1%或0.05％（根据所用铜离子试剂定）（b)三角瓶编号123456葡萄糖标准液（mL)012345蒸馏水（mL)543210铜试剂（mL)555555沸水浴10min，冷却至室温（c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振荡，待红色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量V(d)绘标准曲线葡萄糖含量（mg）为纵坐标，（V0-V)为横坐标第12页，共27页，2023年，2月20日，星期三二蛋白质和氨基酸的化学检测蛋白质含氮量几乎恒定，平均16％测出N含量×6.25，即为蛋白质量含氮量每gN相当P

肉、蛋、豆16％6.25面粉17.6％5.70奶品15.7％6.38花生18.2％5.50鲑精蛋白31.5％3.17第13页，共27页，2023年，2月20日，星期三蛋白质常用检测方法1定氮法（经典的，仲裁的）常用凯氏定氮法或微量凯氏定氮法（1）原理消化、蒸馏、吸收、滴定计算（2）操作要点(a)消化：凯氏定氮瓶，样品＋K2SO4-CuSO4、浓H2SO4,通风厨内进行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。第14页，共27页，2023年，2月20日，星期三第15页，共27页，2023年，2月20日，星期三(b)蒸馏：防止漏气(c)吸收：5mL2％H3BO3＋甲基红－溴甲酚绿几滴或一定量标准酸溶液（如25mL0.05mol/LH2SO4)(d)滴定计算：H3BO3吸收：0.01mol/LHCl滴定至绿色→淡紫红色样品中的总氮量（mg)=（A-B)×C×14×n标准硫酸接收：0.1mol/L标准NaOH滴定，甲基红→黄色终点样品中总氮量=（C1V1-C2V2)×14×n粗蛋白含量＝样品的总氮量×6.25第16页，共27页，2023年，2月20日，星期三2双缩脲试剂法测定蛋白质缩脲＋CuSO4、NaOH→紫红色化合物A∝C缩脲蛋白质含有两个以上脲键，有双缩脲反应蛋白质（多肽）＋CuSO4→（NaOH）→铜－钠－双缩脲络合物A∝Cp，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关Tris缓冲液干扰P的测定，测定范围1～10mg/mL第17页，共27页，2023年，2月20日，星期三操作：（1）双缩脲试剂的配制CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、0.1%KI(2)标准曲线的制作1％标准酪蛋白(mL)00.20.40.60.81.0蒸馏水(mL)1.00.80.60.40.20双缩脲试剂(mL)444444室温反应30min测A540(3)样品测定1mL＋4mL双缩脲试剂，30min，测A540第18页，共27页，2023年，2月20日，星期三3福林－酚试剂法测定蛋白质含量双缩脲法的发展，灵敏100倍，需时较长，对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。碱性铜试剂——双缩脲反应稀释的苯酚试剂——与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应呈蓝色两种呈色反应可叠加第19页，共27页，2023年，2月20日，星期三操作：（1）福林－酚试剂的配制甲液：碱性铜试剂（A、NaOH、NaCO3,B、CuSO4和酒石酸钾钠)乙液：稀释的苯酚试剂（2）标准蛋白溶液配制结晶牛血清蛋白溶于0.9％NaCl或用酪蛋白（凯氏定氮法测定含量）（3）标准曲线制作（4）样品测定1mL样品（含P15～500μg）＋5mL甲液，室温10min，＋乙液0.5mL，混匀，室温30min，测A500~750第20页，共27页，2023年，2月20日，星期三蛋白质的免疫化学检测概念：免疫化学检测、抗体、抗原、凝集反应、沉淀反应检测方法：（1）凝集反应效价测定，细菌、病毒分类（2）沉淀反应沉淀反应、界面（环状）试验、免疫扩散、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等第21页，共27页，2023年，2月20日，星期三氨基酸含量测定方法1茚三酮显色法微酸性条件下，氨基酸茚三酮反应生成紫色化合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物取1mL样品溶液（含氨基酸0.1～50ug)加1mL缓冲液（pH5.0～6.7），再加1mL茚三酮显色液，100℃水浴15min，自来水冷却后，加入3mL60％乙醇溶液，测定OD570，脯氨酸或羟脯氨酸测OD440第22页，共27页，2023年，2月20日，星期三2甲醛滴定法测定氨基酸氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氢氧化钠来测定。加进甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定。注意：需用过量中性甲醛。第23页，共27页，2023年，2月20日，星期三三核酸的化学检测根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测。1定磷法测定核酸含量（1）核酸的消化（2）磷的测定定磷试剂，45℃水浴25min，冷却至室温测OD650无机磷标准液作标准曲线（3）核酸含量的计算一般DNA含磷9.5％,RNA含磷9.2％，RNA量＝（总磷量－无机磷量）×10.9DNA量＝（总磷量－无机磷量）×10.5第24页，共27页，2023年，2月20日，星期三2二苯胺法测定DNA含量DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收峰。在40～400μg范围内，OD595与DNA浓度成正比。少量乙醛可提高反应灵敏度。（1）二苯胺试剂的配制（2）标准曲线制作（3）样品DNA含量测定第25页，共27页，2023年，2月20日，星期三3地衣酚法测定RNA含量核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与3，5－二羟甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，OD670与RNA浓度成正比。所有戊糖均可进行此反应，注意干扰（如DNA）。操作：地衣酚试剂配制；标准曲线