基于诊断的核酸序列突变分析方法：PCR、杂交和NGS

-.z.翻译自DiagnosticsbasedonnucleicacidsequencevariantprofilingPCR,hybridization,andNGSapproacheS基于诊断的核酸序列突变分析方法：PCR、杂交和NGS摘要核酸序列的突变与许多疾病相关。对DNA/RNA类生物标记物的可靠检测和定量能够为我们提供有效的治疗方法，使精准医疗成为可能。临床使用的核酸分析技术可大概分为PCR、杂交和NGS这三类以及它们的混合使用方法。本文综述了当前主要商用分析方法的分子机制及其转化为体外诊断的进程。目录1.前言................................................................02.聚合酶链式反响.....................................................02.1.ARMS和相关技术....................................................02.2.BlockerPCR.........................................................02.3.多重PCR...........................................................02.4.数字PCR...........................................................03.杂交................................................................03.1.微阵列............................................................03.2.荧光条码..........................................................03.3.原位杂交..........................................................03.4.其他读取方式......................................................04.NGS.................................................................04.1.主流NGS平台.....................................................04.1.1.Illumina.........................................................04.1.2.IonTorrent......................................................04.2.其他NGS平台.......................................................04.2.1.PacificBiosciences.................................................04.2.2.O*fordNanopore..................................................04.2.3.Genia.............................................................04.3.序列富集.............................................................04.3.1.杂交捕获........................................................04.3.2.AmpliSeq.........................................................04.3.3.Droplet-basedenrichment...........................................04.3.4.Ligation-basedenrichment...........................................05.作者观点............................................................05.1合成生物学5.2合成生物学促进DNA诊断的开发6.DNA诊断的未来能力有限，翻译中有很多错误之处。强烈建议查看原文，以更好的理解作者的意图。1前言人体DNA序列的突变非常普遍；一些研究认为，两组不相干的人基因组中，每300个核苷酸中就有一个不同。由于这些突变发生在含子或者是不改变氨基酸序列的无义突变，其中绝大局部对表型只有很小或者没有影响。然而大量的遗传性疾病是由单基因的序列突变引起的，而且突变在肿瘤生长和转移的过程中至关重要。同样，病原体DNA的序列突变也会对人体安康造成不同程度的影响，其中病原体的耐药性已经成为世界围的医疗卫生问题。许多对序列突变的检测和定量技术被用于疾病和基因组的研究。这些技术可以概括为三类以及这三类的混合使用：聚合酶链式反响〔PCR〕，杂交技术和下一代测序技术〔NGS〕〔图一〕。每种技术各有优缺点，本文会对他们进展比较分析。本文写作期间有大量的PCR和杂交分析技术被FDA认证批准作为体外诊断试剂。而NGS仍处于临床应用的初期，仅有illumina和IonTorrent在2014年获得FDA认证。一些公司，特别是基因安康管理公司，通过实验室自建工程〔Laboratorydevelopedtest，LDTs〕而非体外诊断，来提供临床NGS分析效劳，但是LDTs最近也被纳入FDA监管围。详情见BO*1对IVDs和LDTs的解释。FigureSEQFigure\*ARABIC1可用于序列突变检测和分析的技术汇总。三类方法：PCR、杂交和NGS。这三类技术会有所重叠，并且许多技术可以联合使用。BO*1:美国对于应用于临床的DNA检测的监管规则。体外诊断〔体外诊断〔IVDs〕。美国政府定义IVDs：预期用途为疾病诊断或其他条件〔安康状态测试，用于疾病的预防、治愈，缓解、治疗〕的试剂，仪器和系统。医疗器械被分为一类、二类和三类。第三类需要最复杂和最严格的监管审查。大局部DNA检测被归为第二类医疗器械〔比方肺结核PCR和囊胞性纤维症NGS〕FDA监管商用IVDs产品，对其平安性和有效性进展合理保证。为了能够合法出售IVD产品，需要提交给FDA一份上市前文件，满足以下要求之一：1〕510(k)许可。2)创新许可或3〕上市前批准。FDA510(K)许可〔FDAcleared〕是最容易通过的，但需要向FDA证明，该产品"实质上等同〞于以前通过FDA510(K)许可过的产品，最终都要追溯到1976年以前的产品或者是FDA新批准的产品。如果新研制的产品如果没有适宜的等同设备存在，则也能获得许可，但FAD会认为该产品有低等到中等的风险。FDA批准〔FDAapproved〕是对第三类IVD产品的最高等级监管。实验室自建工程〔LDTs〕。在*个特定的实验室内一些新的检测工程被建立、评估和验证。这些检测工程叫做实验室自建工程。这种检测只能在该实验室内使用，不能外传或者出售给其他任何实验室或者医疗保健机构。通常情况下，实验室将选择开发和使用LDT是因为当前没有商业化试剂盒可用。联邦政府通过医疗保险和医疗补助效劳中心〔CMS〕和临床实验室改良修正案〔CLIA〕很大程度上地管理其开发、评估和实验室自建工程的使用。在美国大约有25万所CLIA实验室，其中绝大多数LDTs相对简单〔如血液固醇检测〕且没有经过FDA的评估。IVDs是在一个地方生产出来然后卖给医院并给临床决策提供诊断信息的仪器或试剂盒。与之相反，LDT是医生或者医院把病人的样本邮寄给CLIA实验室，并在数天后收到实验室的检测报告。与IVDs不同，LDTs并不需要临床验证，尽管许多上市的LDTs进展过大量的临床验证，如基因安康公司的对乳腺癌复发可能性的预测的治疗标准OncoTypeD*assay。LDTS监管的不确定性，2014年10月，FDA提出了一个监管LDTs框架，被看作是应对越来越多的基于NGS的癌症检测LDTs的举措。FDA报告受到了病理学家，CLIA,CMS不同程度的质疑。美国病理学会和美国分子病理学会提出了建议以及替代方案。此文章写作期间，在未来，对LDT监管仍不明确。DNA序列突变检测在疾病的学多阶段都是有用的，每一个阶段有不同的临床价值。详见BO*2，诊断测试的分类汇总。从技术层面来讲，序列突变检测中，应用不同需要的性能水平也会不同。比方生殖细胞常染色体显性突变风险评估中，50%的突变靶标可被稳定检测区分出来。对于用来检测并判断治疗方法的肿瘤活检样本来说，与野生型序列相比可能只包含5%的突变。对于非侵入性筛查和循环应用的外周血来说，DNA测试必须足够特异才能够检测到突变频率为0.1%或更低的等位基因。临床应用的DNA分析技术的开展必然滞后于科学研究，因为对诊断测试来说，高分析精度是必要但不充分条件。FDA认为IVDs要满足临床所需求的高灵敏度和特异性。BO*3是对这些指标要求的详细说明。BO*2：DNA诊断的临床作用能给为临床决策提供有用信息，是一个有价值的能给为临床决策提供有用信息，是一个有价值的DNA诊断所必须的。因此DNA诊断测试可依据病人类型和根据检测结果所能得出的相应决策来分类。风险评估。一局部携带有种系突变的人群〔可遗传〕罹患*种疾病的风险要高。分析无明显病症的个体在将来患有*种疾病的可能性即为风险评估。例如MyriadGenetics公司推出的女性乳腺癌风险评估：BRCA1/2测试。筛查。对一些疾病来说，传统的诊断方法具有侵入性或不方便，因此在没有明确的疾病病症的情况下会很少使用。分析无明显病症的个体，尽可能在疾病发生的早期检测出来即为筛查。例如E*actSciences公司为55岁以上人员提供的筛查结直肠癌的测试：ColoGuardtest诊断。患者可能出现非特异的疾病迹象〔比方：疼痛，低血压〕，许多疾病都有这些病症。诊断检测能够提供明确的疾病评估。例如：罗氏的SeptiFast检测。可在6h内直接检测覆盖90%血流感染常见致病菌的25种细菌或真菌。预后。诸如癌症等疾病，有较长时间跨度和复杂的病情开展状况。疾病分级的预后分析能够提供能可供参考的治疗方案。例如：GenomicHealth公司的OncoTypeD*检测，能够通过检测乳腺癌活体组织中相关RNA的表达水平，来评估乳腺癌复发的可能性，为患者是否需要化疗提供参考。疗法选择。对于*一疾病来说，有多种治疗方法。会根据成效、副作用和价格来选择治疗方法。许多癌症治疗方法，如酪氨酸激酶抑制剂，只对特意人群有效或者对耐受性肿瘤无效。例如：FoundationMedicine公司的FoundationOnepanel分析了315个基因突变的转移性肿瘤，结果说明一线治疗方案对这些肿瘤无效。监控。随着治疗的进展，病人的病情会得到好转，但是复发的风险也会升高。通过对癌症患者外周血中DNA进展分析来监控术后病情，是一个能够提升治疗效果的有前途的新方向。尽管当下没有大*围使用的产品，一些公司如Sysme*Inostics和GuardantHealth已宣布将要研发对于低水平突变的癌症复发检测试剂。BO*3：性能指标分析在使用特异性和灵敏度这两个表述在使用特异性和灵敏度这两个表述DNA分析性能的概念时，会有些许混淆。在实验室早期的概念验证阶段，一个DNA序列突变检测分析方法的分子灵敏度为：能够准确的检测出来的目的DNA序列的数量或浓度〔例如20拷贝〕。分子特异性为：目的突变DNA序列产生的信号高出野生型或其他突变的程度〔如：检测到的阳性样本的信号值与阴性对照信号值的商〕。对NGS来说，分子特异性即为其测序过程的固有错误率。评估一个检测试剂的分析灵敏度和分析特异性，要有一套阳性和阴性对照样本，阳性对照样本有突变目的序列，阴性对照样本无突变。这些样本已经被第三方验证过。分析灵敏度：阳性对照样本中，被评估试剂所能正确的检测出为阳性的样本所占阳性对照样本总数的比率。分析特异性：阴性对照样本中，被评估试剂所能正确的检测出为阴性的样本所占阴性对照样本总数的比率。一般情况下，一个检测试剂的分析特异性和分析灵敏度要非常接近100%，才能上市成为诊断试剂。临床灵敏度和临床特异性要考虑对患者疾病诊断的有效性。临床灵敏度：正确的检测为阳性的病患数占disease-positivepatients〔有该疾病〕的比率。临床特异性：正确的检测为阴性的人数占disease-negativepatients〔无该疾病〕的比率。由于临床灵敏度和特异性不能用来计算低水平的信息如DNA靶标序列，所以要用其他算法来进展比较。通常，FDA需要公司提交临床灵敏度和特异性数据。其他临床比照分析指标包括内容和平台的考量。内容即为被作为疾病检测靶标的基因或突变。平台即为运行检测程序的仪器和试剂。分析灵敏度和特异性展现平台的性能，而临床灵敏度和特异性则展现内容和平台两个方面的性能。内容和平台都可能成为诊断测试性能的瓶颈。此外，市场一般要求这些测试能够为临床治疗提供有用的信息，否则这些测试就没有多少临床实用性，付费机构，如医保中心等就不会提供报销。最后，即使是FDA许可/批准医疗中心报销，IVD仍然面临消费者承受度低的问题。由于以上原因，许多有前途的技术在转化过程中失败。然而，随着公众关注度，政府支持和私人投资的增长，我们预想临床应用的DNA检测技术会在未来几年不断增长。本文不讨论第四种DNA分析和诊断技术，即等温扩增技术。普通等温扩增方法使用聚合酶以靶标序列为模板扩增产物，但是使用酶而不是高温来解链。等温扩增的优势在于只需要精准的温控系统即可，适用于POCT和资源设备匮乏的地区。然而等温扩增在准确定量，多重扩增和序列选择性方面表现较差，因此在医院实验室设备和研究中很少使用。2聚合酶链式反响聚合酶链式反响是用引物，DNA聚合酶和dNTP扩增模板DNA分子的技术。反响液在至少两个温度下循环：一个使双链DNA变性的高温〔如95℃〕，和用于引物结合和聚合酶扩增的低温〔如60℃〕。理论上每一个循环都会使目的序列量加倍，因此即使是很低拷贝的靶标DNA分子也能被快速扩增至能通过荧光或其他方法检测出的摩尔浓度级别。PCR是目前应用最广的DNA序列检测方法。与其他两类检测技术相比，PCR的主要优势在于准确定量，高灵敏度和易于使用。比方，定量PCR作为DNA和RNA定量的金标准，通常被认为要比微阵列和NGS准确。PCR的主要弱点在于：由于引物二聚体的存在会造成假阳性或假阴性，而不能进展高通量分析。〔多重PCR虽然增加了通量，但根本就不能与NGS和微阵列相比〕2.1ARMS和相关技术通过PCR检测序列突变主要依靠寡核苷酸的使用和设计〔引物和blockers〕，来使其扩增突变序列的效率高于野生型。突变阻滞扩增系统〔amplification-refractorymutationsystem，ARMS〕是检测DNA序列突变，包括SNP的早期方法。ARMS的原理是：TaqDNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，在一定条件下PCR引物3’末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接到达区分突变性和野生型基因的目的(Fig.2a)。对单核苷酸多态性〔SNP〕来说，其等位基因突变的情况为50%或0%，ARMS引物有足够的特异性进展稳定检测，也就是能检测出来。但是对活检样本中的体细胞突变检测来说，突变只占到5%或者更低，这时ARMS引物就不能区分突变和野生型序列。一些热不稳定的或者易于被DNA聚合酶识别的错配会导致对野生型的扩增而造成假阳性，这个问题可以通过在正义链或者反义链上设计引物来缓和，DNA的两条链都可以被用来设计引物。另外可以有意在引物接近3’端的地方引入错配〔也就是除了3’端的特异位点，可以人为地引入其他错配来增加特异性〕，当然，这样做会降低目标基因的扩增效率(Fig.2b)。许多公司都有以ARMS技术研发的试剂盒，比方凯杰therascreen，罗氏cobas研发有获得FDA批准的检测肺癌和结肠癌KRAS和EGFR基因突变的试剂盒。这些试剂盒可用石蜡包埋的组织切片进展测试。生物梅里埃TH*ID研发有获得FDA批准的检测黑色素瘤BRAF基因突变的试剂盒，同样可用石蜡切片。艾德生物研发的大量癌症突变检测试剂盒获得FDA批准以及欧盟IVD产品认证。等位基因特异性blockerPCR中Blocker的应用以及竞争性等位基因特异性TaqmanPCR〔Fig.2c〕使ARMS技术得到显著提升。Blocker是一个可以和野生型模板完美结合的寡核苷酸，从而抑制ARMS引物对野生型模板的结合。Blocker需要进展化学修饰以阻止聚合酶在其3’端延伸〔磷酸化或者加MGB〕，并增加其结合的稳定性。AppliedBiosysterms研发并上市了castPCR试剂盒，可检测45个癌症基因中的586个突变位点，只用于研究，并没有被FDA认可。另一个等位基因特异性PCR的可用方法是使用两段引物〔就是一个引物分为两段，中间可以连接，也可以不连〕，比方Seegene公司的DPO技术和SwiftBiosciences的myT引物〔Fig.2d〕。这些引物均包含一个长的5’区域，主要用来结合靶标基因并使杂交稳定，一个短的3’区域，主要负责特异性结合。DPO和myT引物比ARMS引物特异性更强，在短的3’区域的单个核苷酸的错配要比在长区域的错配更不稳定，也因此更特异。Seegene的单纯性疱疹病毒检测试剂盒已得到FDA的批准。Fig2.等位基因特异性PCR引物检测序列突变〔a〕ARMS引物。3’端能与突变序列完美结合，而与野生型发生错配。Taq或者其他DNA聚合酶对错配引物的扩增效率明显较低。〔b〕在3’端倒数第二个位置人为引入一个错配碱基，虽然扩增效率会有所降低，但是对野生型的扩增几乎完全被抑制。〔c〕asbPCR和castPCR中使用的ARMS引物和blocker。Blocker与引物竞争性的结合野生型的模板，因此野生型扩增进一步受到抑制。由于杂交热力学，blocker对突变序列和引物的结合没有显著的影响。〔d〕DPO和myT引物有两个片段组成，一个较长的5’结合片段和一个较短的3’结合片段。DPO引物的两个片段间通过肌苷连接。myT引物的两个片段通过直角双链DNA连接。2.2BlockerPCR另一种可供选择的PCR方法，是通过使用blocker寡核苷酸抑制野生型扩增，来检测序列突变。引物一般没有等位基因特异性，如果没有blocker与野生型结合，引物会以大致一样的效率同时扩增突变型和野生型。BlockerPCR与ARMS相比的优势在于：首先，无需知道突变序列在blocker结合区域的序列信息。其次，在每个PCR循环过程中都能带来特异性，因为引物不能结合已被blocker覆盖的区域。相反，ARMS引物只有在扩增出特异性片段后，才会有特异性。首次报道的使用blockerPCR的案例是使用肽核酸〔PNA〕blocker(Fig.3a).DNA聚合酶无法置换或者降解PNAblocker，因此野生型的扩增在blocker结合区域被终止。设定适宜的退火温度，使blocker与结合区域形成错配囊泡，不能顺利的结合突变序列。同样的逻辑可用于其他类型的blocker分子：DiaCarta's*enonucleicacids(*NA)，被修饰的核酸，比PNA更具亲和性，显著提高区分突变的能力。Biocept'sSelectorassay是使用5’磷酸化修饰的DNAblocker作为经济可行的方案〔PNA和*NA合成费用昂贵〕。PNABio的PNAClampassay可检测EGFR,KRAS,BRAF,PI3K,和IDH1基因的癌症基因突变，指导癌症治疗，已经获得CE-IVD认证。另一种blockerPCR方法是低退火温度共扩增PCR〔COLD-PCR〕和相关的ICECOLD-PCR分析。这些分析方法依靠更加复杂的温控系统，促使blocker与野生型模板结合。Transgenomic公司的M*-ICP分析便是基于ICECOLD-PCR，在美国已经作为LDT工程。IntegratedDNATechnologies研发了一种概念上完全不同的blockerPCR，即RNAseH-dependentPCR(rhPCR)。与其他blocker作用方式不同，它的blocker的5’端是正常的引物，但是在3’区域的突变位点引入了一个RNA核苷〔本来是A现在是rA〕，这个核苷的存在能够阻止DNA聚合酶的扩增，当这个Blocker或者说primer/blocker与突变序列结合后，rA与模板配对，然后被RNAseH2酶剪切，剪切后的引物在DNA聚合酶的作用下进展扩增〔RNAseH2能够特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA常用于cDNA第二链的合成。RNAseH2不能消化单链DNA、单链RNA、双链DNA或双链RNA〕。当primer/blocker与野生型模板结合后，rA并不能与模板匹配，因此就不能被RNAseH2酶剪切，也就不能进展扩增。〔fig3b〕与其他blocker技术相比，rhPCR技术的优点在于，RNAseH2的存在有效的抑制了引物二聚体的形成和基因组的非特异性扩增。Figure3通过blockerPCR的等位基因突变扩增〔a)blockerPCR：引物在待扩增模板的上游，Blocker与野生型序列能够很好的结合，而与突变序列不能完全结合。引物扩增野生型的时候会被Blocker阻止。这里用的blocker可能是PNA(PNAClamp),*NA(DiaCarta),或者5’端磷酸化修饰的DNA(Biocept)(b)rhPCR：含有RNA核苷的引物结合突变序列后，被RNAseH2酶剪切，能够正常扩增。而结合野生型的引物并不能被RNAseH2酶剪切，因此就不能进展扩增。2.3多重PCR以上所述的PCR都有一个问题，多重扩增即同时分析多个突变靶标序列。实现多重PCR需要克制三个主要难点：dNTP的消耗，不同扩增产物的监测和扩增过程中引物二聚体的形成。在单重PCR中随着扩增子的积累，dNTP会逐渐被消耗。在多重PCR中，需要同时扩增多个靶标，高浓度靶标的扩增会显著抑制低浓度靶标的扩增。实时PCR(如定量PCR)需要通过荧光来反响每个循环中扩增子的浓度。Cq值是PCR扩增过程中，扩增产物〔荧光信号〕到达阈值时〔进入指数增长期〕所经过的扩增循环数，与靶标的最初浓度成对数-线型相关。可检测并区分的荧光数量限制了同时定量检测目标的个数。传统的检测荧光有5个。引物二聚体，是引物之间互作形成的短片段扩增子，这些扩增子与靶标序列毫不相干。单重PCR只有2条引物，认真的设计和优化能够有效防止引物二聚体的产生。但是在多重PCR中可能有2N条引物，每条引物都可能与其他引物形成引物二聚体，因此有4N2种可能性会形成引物二聚体。实际应用当中的情况会更加复杂，引物二聚体的情况会更严重。工程学上的解决多重PCR问题的方法是研发仪器和一次性芯片把PCR反响液进展空间分隔，使得每一局部只有一对引物。BiofireDiagnostics(现在属于Biomerieu*)开发的FilmArray系统可以同时扩增10个靶标〔已经可以20个以上〕。Biofire拥有FDA许可的呼吸道和胃肠道感染病检测试剂组。Cepheid2012年发布的一款仪器可进展1000重的PCR分析，相关仪器和试剂已获得FDA认证和批准。2.4数字PCR使用传统PCR方法对低频率的等位基因突变进展检测，在稳定性和定量方面一直面临挑战。即使用最优化的引物和Blocker，由于分子互作的随机性，对野生型序列的扩增也将不可防止的始终存在。尤其是在突变序列的检测中，等位基因频率的定量会受到每步扩增放大的影响。数字PCR(BioradddPCR，RainDanceRainDrop)是把单重PCR反响溶液分散到成千上万个液滴当中，这些液滴是由反响液和油混合形成的乳剂〔Fig.4〕。通过其他微流控方法也可以把反响液进展分散处理(ThermoFisherOpenArray,FluidigmBioMark)。数字PCR的优势是通过把反响液分散为大量的液滴，每一滴里面预期会有0或1个拷贝数的目的序列。0和1最终的形成的信号完全不同，有阳性扩增的液滴因此就能很容易的与无模板的液滴区分开来。由于出现阳性扩增的液滴的数量可直接计数得到，因此定量就变得非常简单。目前，数字PCR被用于学术和临床研究，而且也被LDT采用。例如：TrovagenePCMV600E便是使用数字PCR对尿液样本中BRAF突变的细胞游离DNA进展检测分析。Fig4数字PCR。含有样本DNA和PCR试剂的溶液通过微流控与油混合产生纳升到皮升大小的液滴。每一滴可视为单独的PCR反响液，且每滴仅含有一个或者数个模板分子。因此，很容易区分目的突变和野生型模板的扩增信号。3．杂交杂交是指合成的DNA引物或探针以碱基配对原则结合DNA靶标序列的过程，是现代DNA分析和诊断技术的根底，但是如果没有DNA扩增或信号放大技术，杂交技术不可能拥有现在的分子灵敏度。通常，杂交会与PCR或者荧光显微镜联合使用。近来在传感器技术上的进步让杂交技术不用再依赖DNA扩增。这使得杂交技术可以与PCR和NGS相比肩。与其他两种技术相比，杂交的优势在于：简单、多重和抗变换性，因为是生物物理现象，所以杂交不像酶那样只能在*些条件下反响，它可以在许多缓冲条件下进展。杂交的弱势在于它不能扩增序列，且必须联合信号放大技术或者高灵敏度的信号读取仪器使用。3.1微阵列〔基因芯片〕微阵列通过空间上的合理排列实现多重读取。不同序列的DNA探针被固化在芯片外表的不同位置。通过末端转移酶在含有目的片段核酸样本的3’端添加荧光标记物，然后与微阵列杂交。假设有目的片段结合到探针上，便在探针的位置上产生荧光斑点，荧光的密度表示目的片段的量〔Fig5〕。Fig.5.DNA微阵列分析RNA的表达。被分析的RNA或cDNA会被末端转移酶连接上荧光标记物，然后与微阵列上的不同序列和位置探针进展杂交。特定位置的荧光密度表示目的片段的量。微阵列可直接用来检测样本总量大、表达量高的RNA〔无需核酸扩增〕，也可被用来检测多重PCR反响生成的扩增子。微阵列的灵敏度取决于目的片段与微阵列的杂交效率、照相的荧光显微镜的灵敏度以及微阵列芯片的本底荧光。昂飞公司的基因芯片技术可以在一个芯片上合成上百万个不同的探针，检测限到达每孔1-10拷贝个mRNA。原则上，微阵列能够对核酸浓度进展高质量的定量。但是实际上，不同的基因和转录组、不同的微阵列平台甚至是同一生产商生产的不同芯片都会影响微阵列的定量。第一、杂交量和动力学与芯片外表的探针密度是非线性相关的：高密度的探针之间会非特异性的杂交并随机延伸。第二、目的片段的序列和长度会影响杂交。第三、临近的DNA序列和其他光谱接近的荧光会对荧光强度产生影响。因此，经过优化的微阵列可被认为对不同核算靶标只能提供可重复的相对定量而不是绝对定量。FDA批准或者许可的微阵列诊断试剂：Agendia'sMammaPrintassays能够通过对70个基因的表达分析，提供乳腺癌复发的风险分析。AutogenomicsINFNITICYP2C19assay能够分析基因多态性，以此来指导抗抑郁药和抗癫痫药的用药。Affymetri*'sCytoScanD*能够检测染色体突变，对发育缓慢，智障和先天畸形进展评估。另外，安捷伦的SurePrint基因表达微阵列正在等待FDA许可。3.2荧光编码技术荧光编码技术总共包含有100-1000种荧光编码可供选择和多重读取。荧光编码技术可分为两类：荧光强度编码技术和荧光条形编码技术〔Fig6〕。荧光强度编码根据荧光强度的不同来识别目的序列。Fig6a展示了Lumine*的荧光强度编码技术*Tag，其原理为：用不同配比的两种红色分类荧光染料将直径为5.6微米的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色〔只是荧光强度不同，应该是同一通道，不同荧光强度就是识别条码〕，把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球都对应相应的检测工程。先把针对不同待测物的荧光编码微球混合，然后参加待测物质或者待测的扩增片段，所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反响。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光，红激光用来判定微球的荧光编码，绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度。从而到达快速准确的定量检测目的。假设每种荧光染料的荧光强度可以被区分成30个等级，则*Tag技术就有900个编码可用。Lumine*研发的基于此技术的的呼吸道疾病诊断系统已经获得FDA批准。荧光条形编码技术是根据荧光的排列顺序来识别目的序列。Fig6b展示了通过电场拉伸核酸条码的Nanostring技术，条码有6个不同的位点，每个位点有四种荧光可供标记。相邻位点的荧光必须能够区分开来，排除掉这些组合后，仍然有972种可能的条码组合。原理是设计出捕捉探针和报告探针两种探针，分别与靶mRNA结合。其中捕捉探针标有生物素，用于将杂交复合物固定在cartridge板上；报告探针则带有四色荧光基团，其不同的排列组合方式代表不同的目的基因。将总RNA与这两种探针进展杂交、纯化、固定，扫描报告探针尾部的荧光集团确定其捕获的基因及其表达量。由于基因表达量的鉴定是由荧光集团的排列组合决定的，背景噪音不会影响基因的定量，因此该方法与基因芯片相比具有极高的灵敏度，可用来检测极低丰度的mRNA，即使每个细胞只表达单个mRNA也能够被检测出来，且其准确性与real-timePCR相当，但通量则比real-timePCR高得多。Prosigna是Nanostring研发的通过分析50个基因的表达水平来评估乳腺癌复发可能性的产品，已得到FDA许可。FireflyBioworks〔已被Abcam收购〕研发了另一种荧光条形编码技术，其微米尺寸的水凝胶粒子以其较大的体积和先进的纳米制造技术，可用的条码要比以上几种方法要多得多。Abcam已经把此种技术应用到microRNA的分析研究中。原图图片原图图片易让人误解，换了一个。报告探针有6个荧光位点，每个位点有四种荧光可供标记，这样就有46种可能的组合。每条都有六种荧光这都应该是六个位点，作者意思是四种荧光Fig6基于核酸杂交的荧光编码技术。〔a〕Lumine**Tag荧光强度编码，每个微球有两种荧光染料，两种荧光染料的强度可以用来区分微球上标记的是什么探针，然后通过第三种荧光来检测是否存在目的序列。〔b〕NanostringnCounter条形编码技术。靶标RNA先和报告探针、捕获探针结合形成三聚体，然后依靠捕获探针上的生物素固定在平台上，施加电场，此时三聚体的核酸链成线性伸展开来，就会看到不同荧光斑点组成的条带。3.3原位杂交原位杂交〔Insituhybridization,ISH〕不仅能够提供靶标基因的序列和浓度，还能在组织标本上对靶标进展定位，使得ISH特别适合对异质细胞或组织样本的拷贝数突变〔Vs〕进展检测分析，而且检测信号非常强。进展原位杂交首先要把需要成像的核酸用甲醛或甲醇固化在细胞的蛋白基质上以防止核酸降解和扩散〔Fig.7〕。然后，DNA或RNA寡核苷酸探针与经过固化处理的目的核酸杂交，洗脱没有结合的探针。最终，选用适宜的显像剂对杂交探针进展显像处理。对荧光原为杂交〔Fluorescentinsituhybridization,FISH〕来说，显像剂可以是荧光染料标记的DNA探针或者是被有荧光抗体的半抗原〔如洋地黄毒苷、地高辛〕修饰的的DNA探针。对色素原位杂交(ChromogenicinSituHybridization,CISH)和银染原位杂交〔silver-enhancedinSituHybridization,SISH)使用半抗原标记的DNA探针，通过结合一抗和二抗最终在酶的作用下显色。与CISH和SISH相比，虽然FISH的灵敏度较低，但是可以同时进展3-5种多重标记，此外，FISH探针可以被漂白或洗脱，可用同一样本重复进展杂交染色，也相当于提高了检测通量。原位杂交可与用DNA和RNA靶标。目前，FISH的临床应用集中在DNA拷贝数突变的检测。RocheVentana和Abbott均开发有获得FDA批准的检测HER2的ISH试剂，用来分析乳腺癌患者对赫赛丁的效果。AdvancedCellDiagnostics近期宣布有意通过其RNAscopFISH分析平台进展HPV诊断。3.4其他读取方法拥有高灵敏度的的靶标或扩增子读取方法还有：电化学读取〔*agenic〕，磁共振〔T2biosystem〕，纳米粒子聚集诱导光散射〔nanosphere〕和化学发光〔HologicHPA〕。其中的一些已经得到FDA许可或作为感染病IVDs被批准。这些方法减弱或者舍弃了PCR扩增这一过程。但是这些仪器的特异性有限，因此更适合检测病菌基因的存在与否，而不是序列的突变。Figure7.原位杂交。图中展示的是用于赫赛丁药效分析的罗氏VentanaHER2分析诊断试剂。固化组织的DNA与半抗原标记的探针杂交，随后与半抗原抗体结合，产生在光学显微镜下可观测的显色信号。DIG(地高辛)andDPN(二硝基苯基)分别别用来标记17号染色体和HER2基因。4下一代测序技术〔ne*t-generationsequencing，NGS〕NGS是一系列高通量DNA/RNA测序方法的统称。与Sanger测序需要均质DNA模板不同，NGS可以对异质样本进展分析，而且对单个样本，能够同时提供超过千万个随机的核酸分子信息。因为高通量，NGS特别适合针对多种基因及其突变的核酸分析和诊断。没有完美的技术。由于信号模糊、酶失真、保护基团剪切不彻底等问题，所有的NGS平台都有一定的在错误率。而测序过程中的错误会增加突变检测的难度，特别是低频突变。近来进展说明通过增加测序深度能够显著降低NGS的错误率。尽管目前没有任何FDA许可或批准的用于癌症诊断的NGS分析平台，但是一些临床肿瘤专家正在使用或者有兴趣使用FoundationOneLDT。4.1主流NGS平台4.1.1IlluminaIllumina测序平台的原理即"边合成边测序〔SequencingbySynthesis)〞，在测序过程中一个个荧光标记的碱基结合到模板上，结合的同时系统会检测荧光并成像〔Fig.8a〕。此平台依靠"桥式PCR〞在一固定有引物的外表扩增出一条扩增子，经过多轮PCR循环，最终形成一个具有完全一样序列的簇。由于每个簇中序列是完全一样的，所以每结合一个碱基，每簇产生的荧光也是一样的〔s://zhuanlan.zhihu./p/20702684"refer=ngs-learning这篇文章讲的很到位，浅显易懂〕。荧光的颜色与碱基相对应，所以通过检测荧光就可以判断碱基序列。此外，桥式PCR很独特的可以从一个DNA片段的两端进展测序，也即双末端测序〔如下列图2〕。双末端测序可以提高读取拼接、插入缺失分析、重排识别和FASTQ质量分数。图1：单端测序首先将DNA样本进展片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flowcell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列。图2：双端测序方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-EndModule)引导互补链在原位置再生和扩增，以到达第二轮测序所用的模板量，进展第二轮互补链的合成测序。Illumina在测序错误率和每轮读取的测序本钱两方面处于领先地位。每簇中单条序列〔直径200nm〕的尺寸决定了每个flowcell的通量，这方面的技术使得Illumina成为检测通量最高的平台〔1.5Tb〕。Illumina正在持续改良flowcell技术以增加数据输出量和质量。最近披露的flowcell可对簇的生成进展精准的控制。目前，Illumina106个读取大概需要花费2美元。容易发生错配容易发生错配Figure8．NGS平台机制。〔a〕Illumina测序的桥式PCR和重复的单个待测DNA片段的荧光成像。目的DNA与两种adaptors结合，这些adaptors可以捕获目的DNA，使其在一个flow-cell的外表进展扩增。在实际测序过程中，每一个循环同时参加四种不同荧光标记的dNTPs和扩增引物，然后模板结合一个核苷酸产生荧光信号，并被检测形成图像，接着添加化学物质，切除荧光基团和阻止扩增的局部，进入下一轮循环，如此往复，就能测出DNA序列。〔b〕IonTorrent通过检测pH来识别核苷酸的结合。在酶延伸和核苷酸结合时，一个质子被释放出来并瞬时改变微孔中的pH。每次添加一种dNTP，同时pH感应器报告微孔中结合的核苷酸。重复序列〔例如AAAAA〕会释放大量质子，而不能被精准定量。另一方面，Illumina平台也是本文介绍的平台中最慢的，每一循环〔核苷酸结合和成像〕大于需要5min，这是因为荧光基团的切除和高分辨率flowcell成像步骤比较耗时间。对于300nt的双末端测序需要整整2天。核苷酸化学或显微镜上的技术进步不太可能显著的降低测序反响时间。诊断应用方面，Illumina已经开发出了通量较低〔＜15Gb〕的台式测序平台〔MiSeq和Ne*tSeq〕。MiSeqD*系统是第一个获得FDA许可的可用于IVD使用的NGS平台。目前，有两个FDA许可的检测囊性纤维化的基因突变的NGS分析试剂应用于MiSeqD*平台上。此外，许多LDTs正在使用Illumina测序为癌症治疗提供相关信息。4.1.2IonTorrentIonTorrent测序平台使用pH而非荧光去识别核苷酸。在引物延伸阶段，每结合一个核苷酸，就会有一个质子离子〔H+〕释放出来〔Fig.8b〕，释放出的质子会引起局部的瞬时的pH变化，而这种变化会被一个连接互补金属氧化物半导体元件的微型pH感应器(离子敏场效应晶体管，ISFET)检测到。测序的每一步只在flowcell中参加一种核苷酸〔比方只参加dATP〕，只有参加与模板相匹配的核苷酸才能检测到pH信号，所有四种核苷酸循环参加完成一个核苷酸的检测。IonTorrentNGS工作流中参加的核苷酸是没有经过修饰的普通三磷酸核苷酸，因此就没有化学切除荧光基团这一步，此外pH感应器是瞬时反响，几乎不耗时间，因此IonTorrent要比Illumina快得多，300nt的读取仅需要3h。另外，IonTorrent仪器使用的PH感应器要比Illumina仪器的光学检测系统廉价很多，所以前者的价格要比后者低得多。最后，IonTorrentNGS平台及其上游的Ampliseq操作标准允许检测分析低至10ng的生物DNA样本〔而Illumina是100ng〕。与Illumina相比，IonTorrent测序的劣势在于其相对较高的固有错误率和每次读取的价格。较高的错误率来自两个方面：一是复杂的PH信号生成元件很难准确的测定4以上的一样核苷酸的信号〔如：AAAAA。测序过程中一次只添加一种核苷酸，如果是AAAAA这种重复序列，添加A后，能够一次扩增5个A，产出5个质子，而PH感应器很难精准的测定出是5个质子〕，二是酶的错配率，如果每次只添加一种核苷酸，酶的错配率会升高。目前，IonTorrent106个读取大概需要花费10美元。IonTorrent的PGM-D*仪器已经得到FDA的临床应用许可。相比Illumina，虽然目前没有发布任何疾病相关的分析试剂，但是IonTorrent把其PGM-D*系统作为一个开放的平台允许临床医生开发或验证临床分析。4.2其他NGS平台4.2.1PacificBiosciences尽管Illumina和IonTorrentNGS平台的测序长度最长为300nt，但PacificBiosciences的SMRT〔singlemoleculerealtime,单分子实时测序技术〕NGS平台的读取长度可以到达10000nt，最长甚至可以到达50000nt。这个特点使得PacBio成为唯一适合高质量的全新基因组组装、亚型分析和构造变异分析的测序平〔.shbio./support/detail/370.html详见此篇文章〕。SMRT测序基于对核苷酸结合正在延伸的DNA链上这一过程的实时观测〔Fig.9a〕。dNTP上的荧光基团标记在γ磷酸位点，荧光基团会随着dNTP配对结合而切除，无需停顿。而Illumina在每个dNTP配对结合后都必须停顿反响，通过化学方法切除荧光基团，最后才能成像。被称为零级波导(zero-modewaveguides,ZMW)的纳米构造使得SMRT测序能够连续不断的检测荧光，而且只能检测到固定有聚合酶的外表附近的荧光，这就大大降低了由游离dNTP带来的背景信号。ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电构造，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，从而使得孔仅有靠近基质的局部被照亮。Φ29DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再参加四色荧光标记的dNTP(A555-dATP,A568-dTTP,A647-dGTP,A660-dCTP)。当DNA合成进展时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。SMRT的测序原理如下列图所示。上面的区域不能被照亮，仅能照亮下部区域上面的区域不能被照亮，仅能照亮下部区域图A显示的是ZMW的构造，激光进入ZMW后呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区域，因此大局部游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP其荧光基团被激光照亮，激发荧光。图B显示的是DNA合成过程中检测到的荧光信号及持续时间。结合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，因而能够与噪音区分。尽管应用了许多新颖的技术，SMRT测序目前仍然存在比Illumina/IonTorrent更高的错误率。PacBio缓解这一问题的方法之一是分散目的基因以进展重复测序。对正义链和反义链上的每个核苷酸进展屡次测序，理论上能够降低错误率。然而通过增加读取深度来降低错误率会限制DNA靶标的长度，丧失PacBio的主要竞争优势。SMRT测序每次读取的费用要比Illumina和IonTorrent高的多。106个读取大概需要花费300美元。2013年PacBio和Roche宣布共同合作研发临床IVD。4.2.2O*fordNanoporeO*fordNanoporesNGS技术与本文介绍的其他技术都不同。它并不依靠聚合酶的延伸作用，而是通过拉动DNA使其穿过酶的纳米孔来实现核苷酸检测，这种酶嵌合在一种合成的聚合物膜上〔Fig.9b〕。当一个核苷酸通过纳米孔复合物时，会引起聚合物膜瞬时电流的改变，这种变化可被检测并用于测序。纳米孔复合物的大小决定其能够同时容纳的影响电流的核苷酸量。纳米孔复合物越小，其容纳的核苷酸就越少，也就越容易确认序列信息。O*fordNanopores的纳米孔蛋白来源于包皮垢分支杆菌，可容纳4个核苷酸，这就意味着有44=256中可能的组合，需要"隐含马尔可夫模型〞去求解得到序列信息〔不懂，这么多种组合怎么找到正确的，是不是每通过一个核苷酸，就会有一个信息，总共有四个信息外加知道是ATCG这个信息，组合起来求解？好复杂〕。大量的可能性给这项技术带来极高错误率。值得注意的是用发卡状的adaptor修饰双链DNA模板，可以通过本技术得到序列的二级构造信息。和Illumina的双末端测序法相似，这种方法也可以呈指数的减少测序的错误率。即令有这么多创新技术，纳米孔的准确率要比PacBioSMRT测序明显偏低。测序费用同样很高，每个cell要750美元，只能做40000个读取。因此O*fordNanopore并不被市场承受。Fig.9.单分子测序技术。〔a〕PacificBiosciences单分子实时测序〔SMRT〕。一个聚合酶被固化到反响池底部接近零级波导(ZMW)附近，ZMW仅能够灵敏的检测到底部附近狭小区域的荧光。当荧光标记的dNTPs结合到模板上，荧光基团会被切除，瞬时发出荧光被ZMW检测到。DNA模板可被打散以对一样序列或者互补序列进展重复测序，降低测序的错误率。〔b〕O*fordNanopore测序。DNA模板在电流的驱动下通过由驱动酶构成的纳米孔，当四个核苷酸通过纳米孔时，会对通过纳米孔的电流产生瞬时的影响，此时的电流被记录并通过隐含马尔可夫模型去解读，最终得到序列信息。〔c〕Genia测序在纳米孔的一侧连接了一个DNA聚合酶。使用PEG修饰的dNTPs。当DNA聚合酶复制模板链时，PEG标签被剪切释放出来，并通过纳米孔。每种dNTP的PEG标签的大小不同，所以通过纳米孔时引起的电流变化不同，以此为信号进展测序。4.2.3GeniaGeniaTechnologies〔已被罗氏收购〕同样开发了一款基于纳米孔的NGS测序平台。与O*fordNanopore不同，Genia测序在纳米孔复合体上连接了一个DNA聚合酶。用四种不同大小聚乙二醇纳米标签分别标记四种dNTP。在引物延伸过程中，这些标签被剪切下来并流过纳米孔，导致电流的改变。目前，Genia测序还没有公布任何生物样本的测序信息，但是罗氏花费3.5亿美元收购Genia的举动说明GeniaNGS平台会在未来几件面市。4.3序列富集人基因组有超过30亿个核苷酸，其中外显子大约有3千万个核苷酸〔1%〕。外显子中，与特定疾病相关的基因只是一小局部。比方FoundationOnepanel只检测315个基因中的大约100万个核苷酸；GuardantHealth360panel只检测68个基因中的15万个核苷酸。因此，为了节约测序本钱，从生物核酸样本中只把感兴趣的目的基因筛选并富集起来进展测序是十分必要的。实现序列富集的两种主要方法：杂交捕获技术和多重PCR扩增技术。杂交捕获使用结合在磁珠上的探针选择性的捕获感兴趣的靶序列，经过洗脱，去除杂序列。多重扩增技术选择性的扩增感兴趣的靶序列，经过扩增，靶序列的浓度将会高于其他序列。Illumina测序一直专注于杂交捕获，而IonTorrent(Ampliseq)主要关注多重PCR扩增。Fig.10。杂交捕获序列富集。首先用物理方法或酶切把基因组DNA片段化，并连接上adaptor。然后与连接有生物素的探针杂交，没有杂交上的杂DNA不能被磁珠捕获而被清洗掉。最后富集的DNA样本进展PCR扩增参加NGS特异的检索标签和引物。杂交捕获杂交捕获的优势在于其可扩展性〔可进展全外显子捕获〕和较小偏差。缺点在于样本需求量较大〔一般要1μg〕并且操作时间长。早在1991年就有了杂交捕获技术，但直到2006年随着AgilentSureSelect技术的推广才被用于NGS并流行起来〔Fig.10〕。使用杂交捕获来进展靶序列富集时，首先要把基因组DNA样本用超声波破碎，使其片段化，然后用连接酶在片段上连接adaptors(接头)。Illumina的Ne*terakits使用转座子复合体只需一步便可完成对基因组的片段化和adaptors的连接。接着这些连接有adaptor的基因组片段进展PCR扩增。扩增的目的是为了增加靶序列的浓度以及为同一个NGS反响中进展测序的多个不同样本添加索引标签〔NGS技术可以实现将多个来源不同的样本混合后在一个测序反响中同步检测，为了区分这些样本，通常采用在每一个原始样本的测序文库中加上唯一的寡核苷酸标签的方法进展标记，这些寡核苷酸标签被称为条码或标签。条码和标签可以包含于接头序列，也可以独立于接头序列〕。扩增子和连接有生物素的杂交捕获探针进展杂交，这一过程需要16-72h。扩增子与探针杂交后，被链霉亲和素磁珠捕获，而没有杂交不被绑定的扩增子则被洗去。绑定的扩增子随后通过参加氢氧化钠溶液或者提高温度被从磁珠上洗脱下来用于测序。通过比照四种主要的外显子富集试剂的综合性能，AgilentSureSelect对预定靶序列的覆盖度最高〔99.8%〕，接着是IlluminaNe*tera，IlluminaTruSeq和NImbleSeqCapEZ〔分别为98.2%，96.9%，96.5%〕。AgilentSureSelect试剂盒在单核苷酸变异〔SNV〕检测方面表现最好，而Ne*tera对高GC含量序列的检测效果最好〔＞60%GC〕。但是这四种试剂盒都在插入和删除类突变检测上表现糟糕。BorealGenomics提供了一种独特的杂交捕获富集方法，一种基于凝胶电泳的别离方法。不懂不翻译。与其他杂交捕获技术捕获特定的一组基因或扩增子不同，BorealOnTarget捕获特定的突变序列。概念验证实验说明此方法成功的捕获循环肿瘤细胞中4个基因〔Kras,BRAF,EGFR和PIC3CA〕的46个突变。因为此方法所用探针的溶解温度必须相近，所以其扩展性受到限制，而且微阵列的常见的缺点它都有。4.3.2.AmpliSeqAmpliSeq是IonTorrent的一款序列富集旗舰产品(Fig.11a)，其主要优势在较低的样本需求量〔1-10ng〕和快捷的操作流程〔3h〕。其主要缺点可能是引物二聚体的存在会导致无效的测序读取。AmpliSeq的工作流程大致分三步：靶序列特异的多重PCR扩增，引物消化和接头连接。第一步由IonTorrent的生物信息学数据库指导，第二不是特有的酶促反响〔Fig11a〕。AmpliSeq多重PCR的能力在目前是无人能及的。例如它的AmpliSeq综合癌症分析平台在四个管共参加16000对引物，每管平均要进展4000重的PCR反响。IonTorrent开发了三种基于AmpliSeq的NGS分析平台：OnineprehensiveAssay,theOnineFocusAssay,和OnineCancerResearchPanel，这些平台可对癌症相关的基因进展深度测序，以检测SNVs，插入或缺失，Vs和基因融合等稀有的序列突变。4.3.3Droplet-basedenrichment液滴富集法与AmpliSeq利用生物信息学方法优化引物设计去除引物二聚体不同，液滴富集法使用与数字PCR一样的技术，使每一滴溶液只进展单重PCR〔Fig.11b〕。不同的液滴含有不同的引物对，这样就能降低引物二聚体存的的可能性。此外引物对的区室化利于平台扩大，可以随意在检测平台中添加新的引物对，理论上无需考虑对已有的引物对产生影响。有两家公司已经开场把液滴富集法应用于NGS：Fluidigm和RainDance。FluidigmAccessArray系统可以用48对引物对48个不同的样本进展平行扩大，形成2304个单独的PCR反响体系，每个反响体系35nl。RainDanceThunderstorm能生成上百万个皮升大小的液滴，有非常高的多重扩增能力。实际应用中，两家公司产品的多重PCR能力依然非常落后于Ampliseq。比方RainDance的ThunderboltRUO癌症平台只能分析230个扩增子。Figure11.多重PCR序列富集。〔a〕IonTorrentAmpliseq。超多重PCR引物根据生物信息学进展设计，然后样本被扩增8-14个循环。无用引物和引物二聚体被酶消化。最后获得的扩增产物通过酶连接上编码接头和测序引物，然后准备进入IonTorrent测序流程。〔b〕RainDance单分子乳化溶液PCR(ePCR)。使用自动制备系统制备上百万各皮升大小的乳化液滴，把片段化的DNA模板分散到每个液滴，每个液滴包含一个或几个DNA片段。把引物对经过同样处理后通过微流控系统，把分别含有DNA片段和引物对的两个液滴混合成为一滴。这样每个液滴就能进展单重PCR富集。4.3.4Ligation-basedenrichment连接富集法Illumina和Agilent开发了基于连接酶的富集法，使小量样本也能进展NGS〔Fig.12〕。这两种方法均需要把分开的两段区域结合在一起，以抑制测序过程中的非特异性扩增。IlluminaTruSeq采用一对与PCR不同的引物，这对引物结合在