第四章工业发酵灭ppt

第四章工业发酵灭ppt第1页，共97页，2023年，2月20日，星期四概念:灭菌、消毒、除菌、防腐灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。

除菌(degermation):用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。

防腐(antisepsis):用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖

。第2页，共97页，2023年，2月20日，星期四在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的不良后果：1.使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。2.杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。3.有些杂菌会分解产物，使生产失败。4.杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。5.如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。第3页，共97页，2023年，2月20日，星期四工业上具体措施包括：1）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子。第4页，共97页，2023年，2月20日，星期四第一节灭菌方法一、热灭菌法

火焰灭菌法干热灭菌法

湿热灭菌法

二、辐射灭菌法射线灭菌法

三、化学药剂灭菌法四、臭氧灭菌五、过滤除菌法第5页，共97页，2023年，2月20日，星期四第二节培养基和发酵设备的湿热灭菌一、概述1、培养基灭菌的定义是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。第6页，共97页，2023年，2月20日，星期四2、培养基灭菌的目的杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。第7页，共97页，2023年，2月20日，星期四3、培养基灭菌的要求达到要求的无菌程度（10-3）。尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：–培养基中不同营养成分间的相互作用；–对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解第8页，共97页，2023年，2月20日，星期四4、湿热灭菌中的相关定义杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。第9页，共97页，2023年，2月20日，星期四各种微生物对湿热的相对热阻微生物相对热阻营养细胞和酵母细菌芽孢霉菌孢子病毒和噬菌体1.03×1062~101~5第10页，共97页，2023年，2月20日，星期四1.微生物热死定律：对数残留定律2.灭菌温度和时间的选择3.影响培养基灭菌的其它因素二、培养基灭菌条件的选择第11页，共97页，2023年，2月20日，星期四1.微生物热死定律——对数残留定律实验证明，在一定温度下，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。式中，N：任一时刻的活细菌浓度（个/L）;t：时间（min）;K：比热死速率常数（min-1）.第12页，共97页，2023年，2月20日，星期四

若开始灭菌（t=0）时，培养基中活的微生物数为N0t=2.303logN0/N/-dN/dt=NlnN/N0=-t积分2.303logN0/N=tor可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和值第13页，共97页，2023年，2月20日，星期四当Nt=0时，t=∞，既无意义，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。第14页，共97页，2023年，2月20日，星期四例：

有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每ml有2×105个耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速度常数为1.8min－1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)N=0.001;=1.8(min－1)

=2.303lgN0N=2.3031.8lg(8×1015)=20.34(min)第15页，共97页，2023年，2月20日，星期四实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120°C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。第16页，共97页，2023年，2月20日，星期四大肠杆菌在不同温度下的残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线第17页，共97页，2023年，2月20日，星期四实验表明，当T变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律

k=Aexp(-△E/RT)（4）式中，A：频率因子（min-1）ΔE：活化能（J/mol）R：通用气体常数[J/（mol.k）]∴k与微生物活化能及T有关，其它条件相同时，ΔE越高，K越低，热死灭速率越慢。第18页，共97页，2023年，2月20日，星期四对（4）两边取对数，得（5）：lnk=−ΔE/RT+lnA（5）–K是ΔE和T的函数，K的对T的变化率与ΔE有关，对（5）两边对T的导数，得（6）由（6）得：反应的ΔE越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大。第19页，共97页，2023年，2月20日，星期四2.灭菌温度和时间的选择

培养物质受热破坏也可看作一级反应：式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数；k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：

都与相应的活化能及T有关第20页，共97页，2023年，2月20日，星期四当T1→T2㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1(∵ΔE>ΔE’)∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌。2.灭菌温度和时间的选择

第21页，共97页，2023年，2月20日，星期四受热物质ΔE（J/mol）维生素B12维生素B1盐酸盐嗜热脂肪芽孢杆菌孢子肉毒梭菌孢子枯草杆菌孢子9623292048283257343088317984第22页，共97页，2023年，2月20日，星期四嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的ΔEBS=67000×4.184（J/mol）维生素B1的ΔEVB=22000×4.184（J/mol）将灭菌温度从105˚C提高到127˚CKVB从0.02（min-1）提高到0.06（min-1）KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min-1）嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和维生素B1的lnK-1/T图第23页，共97页，2023年，2月20日，星期四灭菌温度（˚C）达到灭菌程度的时间（min）维生素B1的损失（%）100110120130140150843757.60.8510.1070.01599.9989271031嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响。第24页，共97页，2023年，2月20日，星期四3.影响培养基灭菌的其它因素

培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。第25页，共97页，2023年，2月20日，星期四pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热；pH<6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。3.影响培养基灭菌的其它因素

第26页，共97页，2023年，2月20日，星期四

温度孢子数灭菌时间(min)(℃)(个/ml)pH=6.15.35.04.74.51201000087533

11510000252516131311010000706535302410010000740720180150150

pH对灭菌时间的影响第27页，共97页，2023年，2月20日，星期四培养基的物理状态——颗粒大小。泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂。培养基中的微生物数量：浓度越高，所需灭菌时间越长。3.影响培养基灭菌的其它因素

第28页，共97页，2023年，2月20日，星期四例如：如肉毒梭状芽孢杆菌，在105℃湿热灭菌时间

芽孢杆菌数/ml时间(min)9×108489×106369×104209×1021492第29页，共97页，2023年，2月20日，星期四二、培养基灭菌的方法（一）分批灭菌（二）连续灭菌第30页，共97页，2023年，2月20日，星期四分空气过滤器灭菌并用空气吹干（一）分批灭菌（实罐灭菌）

1.灭菌工艺过程夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽达70℃左右取样管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保温保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力向罐内通无菌空气保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水培养基降温到所需温度第31页，共97页，2023年，2月20日，星期四第32页，共97页，2023年，2月20日，星期四升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式

㏑(N/N0)=-kt

来粗略估算灭菌所需时间。2.灭菌时间的估算第33页，共97页，2023年，2月20日，星期四2.灭菌时间的估算例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知121℃时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。

解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)Nt=0.001(个)k=1.8(min-1)

㏑(Nt/N0)=-kt

t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]=20.34(min)由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，故实际保温阶段时间比计算值要短。第34页，共97页，2023年，2月20日，星期四3、保证间歇灭菌成功的要素（1）内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象（2）压力稳定的蒸汽（3）合理的操作方法。第35页，共97页，2023年，2月20日，星期四（三）连续灭菌（连消）工艺流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程灭菌时间的计算

㏑(Ct/C0)=－ktt=2.303/k[lg(C0/Ct)]式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后的含菌数。第36页，共97页，2023年，2月20日，星期四例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。连续灭菌时间的估算解：C0=2×105(个/ml)Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min第37页，共97页，2023年，2月20日，星期四分批灭菌与连续灭菌的比较

连续灭菌的优点：（适用于大型罐）

可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。第38页，共97页，2023年，2月20日，星期四缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。

分批灭菌与连续灭菌的比较

第39页，共97页，2023年，2月20日，星期四三、发酵罐的灭菌培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。第40页，共97页，2023年，2月20日，星期四第三节空气除菌空气除菌的必要性以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个周期需通气量2.86×105m3(50×0.7×0.8×170×60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。第41页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌空气的概念发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。第42页，共97页，2023年，2月20日，星期四一、空气中的微生物分布一般寒冷的北方比暖和、潮湿的南方含菌量少；离地面越高，含菌量越少，高度增加10m，微生物数量减少一个数量级；工业城市比农村含菌量高。各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103~104个／m3进行计算。第43页，共97页，2023年，2月20日，星期四二、空气除菌的方法辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、β射线、γ射线、紫外线(2265Å~3287Å)加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量静电除菌：常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。过滤除菌：采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等等。

第44页，共97页，2023年，2月20日，星期四第45页，共97页，2023年，2月20日，星期四三、介质过滤除菌绝对过滤：过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。如聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF）制成的0.3m的微孔滤膜。深层介质过滤：介质的孔隙一般大于微生物细胞。如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。第46页，共97页，2023年，2月20日，星期四深层过滤器除菌机理第47页，共97页，2023年，2月20日，星期四1．惯性冲击滞留作用机理当气流前进时遇到前面的阻碍物而突然改变方向，但颗粒由于惯性力的作用仍然沿直线运动与纤维碰撞而附着在纤维表面，此颗粒就被捕集了。第48页，共97页，2023年，2月20日，星期四2．拦截滞留作用机理当气速降至以下时，惯性冲击作用已不存在，然而存在着另一种作用，即拦截作用来捕集微粒。这是因为颗粒紧紧地随着气流流动，气流改变流向时颗粒也跟着改变方向，当颗粒与纤维表面接触时就捕集了。

第49页，共97页，2023年，2月20日，星期四3．布朗扩散滞留作用机理有些直径微小的微粒在很慢的气速下作不规则的直线运动，这就是布朗扩散。小颗粒呈布朗运动而发生位移，当它与纤维接触就附着于纤维表面而被捕集了。前提是。第50页，共97页，2023年，2月20日，星期四4、重力沉降作用5、静电吸附作用第51页，共97页，2023年，2月20日，星期四当气流速度较高时，以惯性冲击为主，而当气流速度低于一定限度时，以阻拦和扩散为主，并可认为惯性冲击不起作用。此时的气流速度称为临界速度。

第52页，共97页，2023年，2月20日，星期四(三)介质除菌效率介质除菌效率（η）又称介质捕集效率，是指被介质捕集的尘埃颗粒数与空气中原有颗粒数之比。第53页，共97页，2023年，2月20日，星期四N2／Nl：过滤前后空气中的微粒含量比值，即穿透滤层的微粒数与原有微粒数的比值，称为穿透率。第54页，共97页，2023年，2月20日，星期四（四）空气过滤介质棉花玻璃纤维活性炭超细玻璃纤维纸石棉滤板烧结材料过滤介质新型过滤介质

第55页，共97页，2023年，2月20日，星期四1.棉花：品种不同，要求新鲜，纤维长而疏松，贮存时间长的话，纤维易断，易堵塞。2．玻璃纤维：直径小，不易折断，过滤效果好。阻力损失小3．活性炭：强度高，表面积大，空隙大，阻力小，只有棉花阻力的1/12。缺点：体积大，装填费时费力，松紧度不易掌握，空气压降大。第56页，共97页，2023年，2月20日，星期四4．超细玻璃纤维纸：

超细玻璃纤维纸是上好的无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，再以造纸法做成。该过滤为高气速过滤，气流速度越高，效率越高。但超细玻璃纤维纸强度小，易断，多用于分过滤器。为了增加强度，可添加：①

木浆纤维。但效率较低；②

环氧树脂；③

多层复合使用。可增加强度，厚度0.25mm。第57页，共97页，2023年，2月20日，星期四

．5.石棉滤板：20％石棉，80％其它纤维，厚度3～5mm，纤维短，df粗，效率高。特点：不怕水，受潮不易穿孔和折断。第58页，共97页，2023年，2月20日，星期四四、空气过滤除菌的工艺流程1、空气除菌流程的要求

空气应具有一定的压力，过滤器要高效，设备尽量采用新技术，流程尽可能简化，降低动力消耗，工人操作简便，运转费用低。设备中要用无油润滑，否则有油雾，影响过滤效率。第59页，共97页，2023年，2月20日，星期四发酵生产中制备无菌空气的

大致过程

空气空压机贮气罐冷却除油水加热空气预处理总过滤器分过滤器无菌空气

空气过滤第60页，共97页，2023年，2月20日，星期四第61页，共97页，2023年，2月20日，星期四空气的预处理目的:提高压缩前空气的洁净度;去除压缩后空气中的油和水。第62页，共97页，2023年，2月20日，星期四1.提高压缩前空气的洁净度（1）提高空气吸气口的位置（2）在空气入口处设置粗过滤器——捕集较大的灰尘颗粒，并保护空压机。第63页，共97页，2023年，2月20日，星期四高空取气管

为远离地面几十米的管子。每升高10米，空气中杂菌降低一个数量级。因此从高空取气要比从低空取气有利得多。

第64页，共97页，2023年，2月20日，星期四2.空气压缩和压缩空气的冷却（1）空气压缩：克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度。（2）压缩后空气温度显著上升，需冷却，因为压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧增大发酵罐的降温负荷增加培养液水分的蒸发一般用列管式冷却器进行冷却。第65页，共97页，2023年，2月20日，星期四空气贮罐消除压缩机排出空气量的脉冲，维持稳定的空气压力。利用重力沉降作用除去部分油雾。紧接空压机安装。有些装有冷却管。第66页，共97页，2023年，2月20日，星期四3.压缩空气的除油除水

冷却降温后的空气湿度增大，会使过滤介质受潮失效。

两类设备旋风分离器——利用离心力进行沉降，对于10m以上的微粒分离效率较高。丝网分离器——利用惯性进行拦截，分离效率较高，能除去2～5m的细小颗粒。第67页，共97页，2023年，2月20日，星期四旋风分离器第68页，共97页，2023年，2月20日，星期四

采用惯性拦截等机理，有效去除空气中的水、油雾、尘埃，不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。第69页，共97页，2023年，2月20日，星期四4.空气的加热将除油水的空气加热（温差在10～15°C左右），降低相对湿度（达50%～60%）后，输入过滤器。用列管换热器。第70页，共97页，2023年，2月20日，星期四空气过滤除菌设备流程空压机储罐二级冷却加热器空气过滤粗过滤第71页，共97页，2023年，2月20日，星期四空气过滤器过滤除菌的关键设备第72页，共97页，2023年，2月20日，星期四第73页，共97页，2023年，2月20日，星期四几种典型的设备流程两级冷却、加热除菌流程

冷热空气直接混合式空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程将空气冷却至露点以上的流程利用热空气加热冷空气流程一次冷却和析水的空气过滤流程第74页，共97页，2023年，2月20日，星期四

两级冷却、加热除菌流程图1-粗过滤器；2-空压机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网分离器；8-加热器；9-过滤器

第75页，共97页，2023年，2月20日，星期四冷热空气直接混合式空气除菌流程图1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4-冷却器；5-丝网分离器；6-过滤器第76页，共97页，2023年，2月20日，星期四利用热空气加热冷空气的流程示意图1-高空采风；2-粗过滤器；3-压缩机；4-热交换器；5-冷却器；6，7-析水器；8-空气总过滤器；9-空气分过滤器第77页，共97页，2023年，2月20日，星期四将空气冷却至露点以上的流程1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5－冷却器；6－空气总过滤器；7－空气分过滤器第78页，共97页，2023年，2月20日，星期四高效前置过滤空气除菌流程图1—高效前置过滤器；2—压缩机；3—贮罐；4—冷却器；5—丝网分离器；6—加热器；7—过滤器第79页，共97页，2023年，2月20日，星期四一次冷却和析水的空气过滤流程示意图1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5，6—析水器；7—贮罐；8—加热器；9—空气总过滤器；10—空气分过滤器第80页，共97页，2023年，2月20日，星期四180M3发酵罐车间大型空气压缩机第81页，共97页，2023年，2月20日，星期四发酵车间的空气过滤器第82页，共97页，2023年，2月20日，星期四提高过滤除菌效率的措施减少进口空气的含菌数量，主要方法：正确选择进风口；提高进口空气的采气位置；采用粗过滤预处理。设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。针对不同地区，设计合理的空气预处理工艺流程，以达到除油、水和杂质的目的。第83页，共97页，2023年，2月20日，星期四降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作，主要方法：使用无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去除油、水；提高进入过滤器的空气温度。稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。提高过滤除菌效率的措施第84页，共97页，2023年，2月20日，星期四

化学药剂灭菌

某些化学药剂能与微生物细胞物质发生反应而具有杀菌作用。如甲醛、氯（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）等。

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