第十一章色谱基础

第十一章色谱基础1第1页，共68页，2023年，2月20日，星期四一、历史： 1903年，俄国植物学家MikhailIswett最先发明。他采用填充有固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物（叶绿素和叶黄素Chlorophylls&xanthophylls加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱（希腊语中“chroma”=color;“graphein”＝wite）2第2页，共68页，2023年，2月20日，星期四3第3页，共68页，2023年，2月20日，星期四4第4页，共68页，2023年，2月20日，星期四英国学者马丁由于对色谱法作出重要贡献而获得1951年诺贝尔奖。1937-1972年，15年中有12个Nobel奖是有关色谱研究的！5第5页，共68页，2023年，2月20日，星期四二、色谱法共同的基本特点具备两个相：·其中的一相固定不动，称为固定相；·另一个是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。 由于Tswett的开创性工作，因此人们尊称他为“色谱学之父”，而以他的名字命名的Tswett奖液成为了色谱界的最高荣誉奖。·色谱法是一种分离技术，对于复杂有机混合物试样具有极高的分离效率，也是色谱法不同于其他分析方法的显著特点。·到21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥不可代替的重要作用。6第6页，共68页，2023年，2月20日，星期四三、应用 色谱法的发展对有机化学的发展起到了巨大的推动作用，如对天然有机化合物的分离、分析、结构测定；大气、水中有机污染物的测定；农产品、食品中农药残留量的测定；产品质量检测；遗传密码的破译；兴奋剂检测；天然物质中抗癌活性组分的分离分析；宇宙空间有机物质寻找。参考网站：中国色谱网7第7页，共68页，2023年，2月20日，星期四8第8页，共68页，2023年，2月20日，星期四四、色谱法的特点·优点：“三高”、“一快”、“一广”高选择性——可将性质相似的组分分开高效能——反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度——1011～1013g，适于痕量分析分析速度快——几～几十分钟完成分离，一次可以测多种样品应用范围广—气体、液体、固体物质化学衍生化再色谱分离、分析缺点：对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用（GC-MS,LC-MS）9第9页，共68页，2023年，2月20日，星期四五、色谱分离基本原理： 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。·两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础10第10页，共68页，2023年，2月20日，星期四六、色谱分类方法1．按固定相的固定方式分2．按分离机制分：

11第11页，共68页，2023年，2月20日，星期四4．按照展开程序分类 按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和迎头法。12第12页，共68页，2023年，2月20日，星期四5．按使用领域不同对色谱仪的分类13第13页，共68页，2023年，2月20日，星期四14第14页，共68页，2023年，2月20日，星期四11.2色谱流出曲线（色谱图）及有

关术语

混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应15第15页，共68页，2023年，2月20日，星期四一、色谱分离过程·以吸附色谱为例吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→差速迁移→分离分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出16第16页，共68页，2023年，2月20日，星期四二、色谱流出曲线（色谱图，chromatogram）试样中各组分经色谱柱分离后，经过检测器，按先后次序转变为相应的电信号图。17第17页，共68页，2023年，2月20日，星期四三、常用色谱术语：1、基线：没有样品组分流出的曲线，一般是水平线。2．色谱峰：响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线,一般呈正态分布。3．峰高与峰面积峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离峰面积：峰与峰底之间的面积18第18页，共68页，2023年，2月20日，星期四4．保留值（Retentionvalue,R）物理意义：用于表征试样组分被固定相滞留程度。（1）用时间表示的保留值t0死时间:不被固定相吸附或溶解的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据t0可求出流动相平均流速19第19页，共68页，2023年，2月20日，星期四b．保留时间tr:试样从进样到出现峰极大值所经过的时间。包括随流动相通过柱子的时间t0

在固定相中滞留的时间c．调整保留时间trˊ:某组份的保留时间扣除死时间后的时间，表示组份在固定相中滞留时间。 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。20第20页，共68页，2023年，2月20日，星期四（2）用相应的流动相体积来表示的保留值a.死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项，可由下式计算 V0=t0Fco（Fco为流速）仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。

F0-检测器出口流速：Tr-室温；Tc-柱温；Pa-大气压；Pw-室温时水蒸汽压。21第21页，共68页，2023年，2月20日，星期四b.保留体积Vr

从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：VR=tRFcoc．调整保留体积VRˊ某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。22第22页，共68页，2023年，2月20日，星期四3．相对保留值r2,1:组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关。衡量固定相选择性的指标，又称选择因子通常固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰i对标准峰的相对保留值，此时以a表示：a总是大于1的。23第23页，共68页，2023年，2月20日，星期四5．区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。三种表示方法：标准偏差σ：0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354σ峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。24第24页，共68页，2023年，2月20日，星期四色谱流出曲线的意义：·色谱峰数=样品中单组份的最少个数；·色谱保留值—定性依据；·色谱峰高或面积—定量依据；·色谱保留值或区域宽度—色谱柱分离效能评价指标·色谱峰间距—固定相或流动相选择是否合适的依据25第25页，共68页，2023年，2月20日，星期四11.3色谱法基本原理色谱分析的目的:使各组分彼此分离！1.组分在两相间的分配系数相差足够大，即与热力学性质有关。2.传质和扩散足够快,

否则每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。即与动力学性质有关。因此，应从热力学和动力学两方面研究、解释色谱分离行为26第26页，共68页，2023年，2月20日，星期四描述分配过程参数1．分配系数（Distributionconstant,K）它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，是每一个溶质特征值,与固定相和温度有关，与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。

分配系数的差异是所有色谱分离的实质性的原因。27第27页，共68页，2023年，2月20日，星期四讨论1．一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；2．试样一定时，K主要取决于固定相性质；3．每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；4．选择适宜的固定相可改善分离效果；5．试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；6．某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。28第28页，共68页，2023年，2月20日，星期四2．分配比:1)定义：在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，它反映了组分在柱中的迁移速率。其中Vm≈V0，近似等于死体积V0,Vs为固定相体积。2）意义：k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，与体积相关,是容量因子，分配系数是溶质因子。29第29页，共68页，2023年，2月20日，星期四3）分配比k值可直接从色谱图中测得A．组分滞留因子Rs，由于固定相对组分有保留作用，所以us<uB．又因为：C．因此，得到：分配比与保留时间关系30第30页，共68页，2023年，2月20日，星期四3．K(分配系数)与k(分配比)的关系：β称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。填充柱，β=6-3.5；对毛细管柱，β=60-600。4．选择因子α：色谱柱对A、B两组分的选择因子α定义如下：A为先流出的组分，B为后流出的组分。通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。31第31页，共68页，2023年，2月20日，星期四注意：分配系数K分配比k及选择因子α的关系K或k反映的是某一组分在两相间的分配：而α是反映两组分间的分离情况！当两组分K或k相同时，α=1时，两组分不能分开；当两组分K或k相差越大时，α越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。α和k是计算色谱柱分离效能的重要参数！32第32页，共68页，2023年，2月20日，星期四小结：（1）色谱条件一定时，K或k值越大，则组分的保留值也越大。（2）两个组分的K或k值相等，则两个组分的色谱峰必将重合。（3）两个组分的K或k值差别越大，则相应的两色谱峰相距就越远。33第33页，共68页，2023年，2月20日，星期四例题某色谱柱,固定相体积为0.5mL,流动相体积为2mL.流动相的流速为0.6mL/min,组分A和B在该柱上的分配系数分别为12和18,求A、B的保留时间和保留体积。Tr=tm(k+1)k=K/βtm＝Vm/F0

β=Vm/VsTr(A)=2/0.6*[(K*Vs/Vm)+1]=2/0.6*[(12*0.5/2)+1]=13.33minTr(B)=2/0.6*[(18*0.5/2)+1]=18.33minVr(B)=tr(A)*F0=13.33*0.6=8mlVr(A)=tr(B)*F0=18.33*0.6=11ml34第34页，共68页，2023年，2月20日，星期四色谱理论色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制.（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽,色谱过程的动力学因素控制（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；35第35页，共68页，2023年，2月20日，星期四二、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述1．塔板理论（Platetheory）—柱分离效能指标 1952年，Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。36第36页，共68页，2023年，2月20日，星期四塔板理论假定：1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n>50时，峰形接近正态分布。37第37页，共68页，2023年，2月20日，星期四塔板数n可用以评价一根柱子的柱效。色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H,色谱柱的理论塔板数：n则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：n越多，H越小、色谱峰越窄，则柱效越高。38第38页，共68页，2023年，2月20日，星期四2．有效塔板数有效塔板高度·计算出来的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tr计算时，没有扣除死时间tM，所以需引入有效塔板数和有效塔板高度表示柱效：39第39页，共68页，2023年，2月20日，星期四有关塔板理论的说明：1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降，延长柱寿命。3）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。40第40页，共68页，2023年，2月20日，星期四该理论缺点:不考虑分子扩散、其它动力学因素。不能解释峰形为什么会扩张？不能解释影响柱效的动力学因素是什么？柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同的，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。41第41页，共68页，2023年，2月20日，星期四2．速率理论（Ratctheory）-考虑扩散传质因素vanDeemter方程：u为流动相线速度：A，B，C为常数，其中 A—分别表示涡流扩散系数； B—分子扩散系数； C—传质阻力系数（包括液相和固相）。 从动力学角度解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。H与u成反比H与u成正比42第42页，共68页，2023年，2月20日，星期四1）涡流扩散项由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”；从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性——同一组分运行路线长短不同——流出时间不同——峰形展宽。展宽程度以A表示： A=2λdp

dp—填充物平均直径；λ—填充不规则因子。使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。43第43页，共68页，2023年，2月20日，星期四2）分子扩散项因浓度梯度面向前后自发地扩散，使谱峰展宽。 B=2γD

(样品注入时呈“塞子”状分布)γ—称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况：D—组分在流动相中的扩散系数。·分子量大的组分，Dg小，即B小·Dg随柱温升高而增加，但反比与柱压；·流动相分子量大，Dg小，即B小：·μ增加，组份停留时间短，纵向扩散小；·对于液相色谱，因Dg较小，B项可忽略。44第44页，共68页，2023年，2月20日，星期四3）传质阻力项-峰展宽因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至衡.a）气相色谱：

·减小填充颗粒直径dp·采用分子量小的流动相，使Dg增加；·减小液膜厚度dj，Cl下降, 但k(容量因子)又减小,Cl增加。但当固定液含量一定,增加比表面来降低dj。但比表面过大会因吸附过强使峰拖尾。·增加柱温，可增加Dl，但k值减小.为保持合适Cl值，应控制柱温。45第45页，共68页，2023年，2月20日，星期四b）液液色谱：传质阻力项C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs。·流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相传质阻Cs力。分别与填充物大小dp、扩散系数（Dm）、微孔大小及其数量等有关。 降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。·固定相传质阻力与液膜厚度dj、保留因子k和扩散系数Ds等有关.降低固定相传质阻力的方法有：与气液色谱中的表述相同。46第46页，共68页，2023年，2月20日，星期四11.4分离度及色谱分离方程

图中（a）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差。图中（b）虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。图中（c）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。由此可见，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引入一个综合性指标——分离度R。47第47页，共68页，2023年，2月20日，星期四一、分离度（Resolution,R）同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：当R<1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7%。R越大，相邻组分分离越好通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。48第48页，共68页，2023年，2月20日，星期四49第49页，共68页，2023年，2月20日，星期四二、色谱分离方程

n柱效α选择因子k分配比也称容量因子说明:针对后流出组分针对两组分,一般大于1R=50第50页，共68页，2023年，2月20日，星期四有关色谱方程的讨论：1）分离度R与柱效的关系可通过增加柱长提高分离度,然而要增加1倍分离度，柱长必须增加四倍,分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。51第51页，共68页，2023年，2月20日，星期四2）分离度R与选择因子α的关系由基本色谱方式式判断，当α=1时，R=0，这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分离。显然，α越大，柱选择性越好，对分离有利。α的微小变化可引起R较大改变。如，当α从1.01倍增加至1.10（增加9%）时，R则增加9倍（但α>1.5,R增加不大）。改变α的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。52第52页，共68页，2023年，2月20日，星期四3．分离度与容量因子的关系如果设：则分离方程式写成k增加，分离度R增加，但当k>10，则R的增加不明显。通常k在2~10，则R的增加不明显。通常k在2~10之间。改变k的方法有：增加柱温（GC）、流动相性质和组成（LC）以及固定相含量。53第53页，共68页，2023年，2月20日，星期四溶剂（流动相）组成对色谱分离的影响1：9，10-蒽醒；2：2-甲基-9，10-蒽醒；3：2-乙基-9，10-蒽醒4：1，4-二甲基9，10-蒽醒；5：2-特丁基甲基9，10-蒽醒；54第54页，共68页，2023年，2月20日，星期四某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温（GC）和梯度淋洗（LC）来解决这个问题。55第55页，共68页，2023年，2月20日，星期四三、分析时间t分析时间通常指最后一个组分出峰的时间由以下三式：得到可见，分析时间与R,α,k、H/u等参数有关。R增加1倍，分析时间则是原来的4倍。实际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析。56第56页，共68页，2023年，2月20日，星期四5．基本色谱分离方程式的应用 在实际中，基本色谱分离方程式是很有用的公式，它将柱效、选择因子、分离度三者的关系联系起来了，知道其中两个指标，就可计算出第三个指标。57第57页，共68页，2023年，2月20日，星期四58第58页，共68页，2023年，2月20日，星期四解法1：先求出组分2对组分1的相对保留值r2,1（即α值）59第59页，共68页，2023年，2月20日，星期四60第60页，共68页，2023年，2月20日，星期四61第61页，共68页，2023年，2月20日，星期四[例2]已知某色谱柱的理论塔板数为3600，组分A和B在该柱上的保留时间为27mm和30mm,求两峰的峰半宽和分离度。62