第十章 色谱分离过程

第十章色谱分离过程第1页，共42页，2023年，2月20日，星期三第一节概述

一、色谱法的由来1．1906年由俄国植物学家Tsweet创立

植物色素分离见图示

40年代TLC，纸色谱50年代GC出现使色谱具备分离和在线分析功能60年代末HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大2．现在：一种重要的分离、分析技术分离混合物各组分并加以分析第2页，共42页，2023年，2月20日，星期三图示固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

色带第3页，共42页，2023年，2月20日，星期三二、色谱法定义、实质和目的

定义：利用物质的物理化学性质建立的分离、分析方法实质：分离目的：定性分析或定量分析

其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。固定相——除了固体，还可以是液体

流动相——液体或气体色谱柱——各种材质和尺寸被分离组分——不再仅局限于有色物质第4页，共42页，2023年，2月20日，星期三当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。

两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础第5页，共42页，2023年，2月20日，星期三三.色谱法的特点（1）分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。

不足之处：被分离组分的定性较为困难。第6页，共42页，2023年，2月20日，星期三第二节色谱分离过程的基本原理一、分离原理

色谱分离过程的实质是溶质在不互溶的固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借助溶质在亮相间分配行为的差别而使不同的溶质分离。以吸附色谱为例吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→差速迁移→分离第7页，共42页，2023年，2月20日，星期三分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出第8页，共42页，2023年，2月20日，星期三二、固定相（色谱柱填料）1.固体固定相a常用的固体吸附剂：活性炭，硅胶，氧化铝，分子筛等作用机理：吸附占主导地位b新型的固体固定相：高分子多孔微球低温时，吸附占主导地位，高温时分配占主导地位c化学键合固定相：分配占主导地位主要用于分析永久性气体，如低级烷烃、氢、氧、一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物、硫化氢等。第9页，共42页，2023年，2月20日，星期三2.液体固定相组成结构：担体+固定液，前者是具有较大比表面、化学呈惰性的一类物质，后者在色谱使用温度下呈液体膜状态，化学性质稳定，不流失或挥发，主要用于分析较高沸点的有机物。对固定液的基本要求：a蒸汽压要低，使用温度下为液体b热稳定要好，不挥发c惰性，与分析物质不产生化学反应。第10页，共42页，2023年，2月20日，星期三固定液的选择原则：“相似相溶”，选择与试样性质相近的固定相。A非极性样品选用非极性固定液（主要作用力为色散力）流出顺序：沸点低的先流出，同沸点的极性组分先流出B中等极性样品选用中等极性固定液（主要作用力为静电力）流出顺序：沸点低的先流出，同沸点的极性小的组分先流出C强极性样品选用强极性固定液（主要作用力为静电力）流出顺序：极性低的先流出第11页，共42页，2023年，2月20日，星期三三、色谱柱及柱技术色谱柱的性能依赖于三个因素：色谱柱填充技术、柱设计和生产1.色谱柱装填方法高压匀浆填充干法填充径向压缩法轴向压缩法环形压缩技术2.色谱柱的设计多采用大直径、短柱长的“饼式”柱第12页，共42页，2023年，2月20日，星期三第三节色谱的分类1.按固定相及流动相的状态分类：液相色谱、气相色谱2.按固定相形状性质分类：柱色谱、纸色谱、薄层色谱第13页，共42页，2023年，2月20日，星期三3.按色谱过程的机理分类：吸附色谱：用固体吸附剂作固定相，利用组分在吸附剂上吸附力的不同，因而吸附平衡常数不同而将组分分离分配色谱：用液体作固定相，利用组分在液相中的溶解度不同，因而分配系数不同进行分离离子交换色谱：利用离子交换原理排阻色谱：利用分子大小不同电色谱：利用带电物质在电场作用下移动速度不同进行分离第14页，共42页，2023年，2月20日，星期三4.可按仪器分:a气相色谱(Gaschromatography)填充柱气相色谱（Packedcolumngaschromatography）毛细管气相色谱(Capillarycolumngaschromatography)裂解气相色谱(Pyrolysisgaschromatography)顶空气相色谱(Headspacegaschromatography)气相质谱联用技术（Gaschromatography-Massspectrometry）b液相色谱仪(Liquidchromatography)高效液相色谱(Highperformanceliquidchromatography)超临界流体色谱(Supercriticalfluidchromatography)高效毛细管电泳(Highperformancecapillaryelectrophoresis)毛细管电色谱(Capillaryelectrochromatography)液相质谱联用技术（Liquidchromatography-Massspectrometryc平面色谱法（Planarchromatography）薄层色谱(Thinlayerchromatography)薄层电泳色谱(Thinlayerelectrophoresis)纸色谱(Paperchromatography)第15页，共42页，2023年，2月20日，星期三

(1)色谱过程热力学——高选择性色谱分离的理论基础；⑵色谱过程动力学——高效色谱分离的理论基础；⑶色谱分离条件的选择——多元混合物分离最优化理论。

色谱理论研究色谱过程中分子运动的规律，探讨微观分子运动与色谱分离的内在联系。它包括三个基本理论问题：第四节色谱分离过程基础理论第16页，共42页，2023年，2月20日，星期三一、色谱过程

色谱柱检测器色谱图

组分在色谱柱内运动溶质浓度分布柱内：谱带柱后：色谱峰色谱仪第17页，共42页，2023年，2月20日，星期三

差速迁移指不同组分通过色谱柱时的移动速度不同。样品注入色谱柱时，由于流动相以一定速度通过固定相，使样品中各组分在两相之间进行连续多次的分配。由于组分与固定相和流动相作用力的差别，在两相中的分配系数不同。在固定相溶解或吸附大的，即分配系数大的组分，迁移速度？

慢

在固定相溶解或吸附小，即分配系数小的组分，迁移速度？

快第18页，共42页，2023年，2月20日，星期三

结果是样品各组分同时进入色谱柱，而以不同的速度在色谱柱内迁移，导致各组分分离。组分通过色谱柱的速度，取决于各组分在色谱体系中的平衡分布。因此，影响平衡分布的因素，即流动相和固定相的性质、色谱柱柱温等影响组分的迁移速度。第19页，共42页，2023年，2月20日，星期三二、保留值、分离度和柱效率

1.保留值通常以保留时间tR及容量因子k’表示保留时间tR：从进样开始到某组分色谱峰顶（浓度极大点）的时间，即组分在色谱柱中的停留时间或组分流经色谱柱所需要的时间。第20页，共42页，2023年，2月20日，星期三容量因子(新定义为保留因子，Retentionfactor)在色谱法中，保留值是表示组分在色谱柱内滞留状况的一个指标。而容量因子（k）是一个具有普遍意义的色谱保留值，它指在一定柱温下,溶质在两相间达到分配平衡时,分配在固定相和流动相中的总量之比。

k=ws/wm=K·Vs/Vm=K/可见，k与组分的分配系数K和相比有关，但与流动相流速无关。k值大小可直接从色谱图上测量。有关计算式如下：tr=t0(1＋k)Vr=Ftr

基本保留方程分离因子恒流速t0的测定第21页，共42页，2023年，2月20日，星期三2.分离度分离条件的选择主要是提高“难分离物质对”的分离度峰宽分离度R国家标准分离度

当两峰高相差不大,且峰型接近时可以认为W1=W2=W当R=1时，分离程度达到94%当R=1.5时，分离程度达到100%第22页，共42页，2023年，2月20日，星期三3.柱效应色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N---理论塔板数tR---保留时间W1/2---半峰宽Wb---峰底宽度理论塔板高度：L---柱长第23页，共42页，2023年，2月20日，星期三三、平衡色谱理论

Wilson等人提出的平衡色谱理论的三个基本假设：l.溶质在流动相和固定相之间的分配平衡在整个色谱过程中都能瞬间实现；2.传质阻力，纵向扩散对平衡的影响可以忽略；3.溶质在色谱柱迁移过程中，在一定时间内，色谱柱每一小段溶质量的变化符合物料平衡原理。第24页，共42页，2023年，2月20日，星期三

流动相固定相

平衡色谱理论物料平衡示意图

根据物料平衡：

溶质在两相间的分配或吸附平衡常数：第25页，共42页，2023年，2月20日，星期三通过数学处理，组分的保留值为：

从平衡色谱理论导出的溶质谱带迁移速率方程及相应的保留时间、保留体积表达式，初步揭示了物质在色谱柱的差速迁移过程。非线性等温线比较好地解释了不对称色谱峰，特别是拖尾峰的成因。但它未能阐明色谱流出曲线，实际应用比较有限。

根据平衡色谱理论，当分布等温线呈线性时，溶质的K为常数，谱带迁移速率不变，不产生色谱谱带扩张。若分布等温线为非线性，则K随Cm变化溶质迁移速度亦变化，引起色谱峰扩张，形成不对称色谱峰。第26页，共42页，2023年，2月20日，星期三四、塔板理论(theplatemodel)

1941年，Martin和Synge阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；与精馏相似，色谱分离也是一个分配平衡过程。这就是Martin等人提出的塔板理论。掌握这一理论的要点是：假设→二项式分布（概率密度函数）→流出曲线→实验事实第27页，共42页，2023年，2月20日，星期三塔板理论基本假设固定相，流动相，H,vm，v3l

色谱柱由一系列塔板组成l

塔板内，组分在两相间迅速达到平衡（理想色谱）l

组分的分配系数不随它的浓度变化而变化（线性分布等温线）l

组分的轴向扩散为零l

流动相的流动是跳跃过程第28页，共42页，2023年，2月20日，星期三流动相固定相塔板号0123r-1r塔板理论示意图

如果把上述错流萃取过程继续下去，即“平衡→转移→再平衡→再转移→。。。”第29页，共42页，2023年，2月20日，星期三

0加样

0平衡流动0101再平衡流动012

塔板理论示意图

第30页，共42页，2023年，2月20日，星期三第五节典型制备色谱工艺及应用一、模拟移动床色谱（simulatedmovingbed,SMD）SMB色谱分离技术是20世纪60年代发展起来的一种现代化分离技术,具有分离能力强,设备体积小,投资成本低,便于实现自动控制并特别有利于分离热敏性及难以分离的物系等优点,在制备色谱技术中最适用于进行连续性大规模工业化生产。

第31页，共42页，2023年，2月20日，星期三1.模拟移动床色谱的原理

SMB色谱由多根色谱柱（大多为5-12根）组成。每根柱子之间用多位阀和管子连接在一起，每根柱子均设有样品的进出口，并通过多位阀沿着流动相的流动方向，周期性地改变样品进出口位置，以此模拟固定相与流动相之间的逆流移动，实现组分的连续分离第32页，共42页，2023年，2月20日，星期三2.建立SMB色谱分离工艺的步骤（1）设置工艺要求（2）确定溶解度（3）选择固定相（4）优化分离条件（5）工艺参数模拟（6）中试研究第33页，共42页，2023年，2月20日，星期三3.SMB色谱的应用

20世纪90年代以来，SMB色谱开始用于药物尤其是手性药物的分离，到现在SMB已发展到吨级工艺。SMB色谱技术在生物分离领域也有较广泛的应用。SMB色谱正逐步地取代cyclosporinA的传统间歇色谱纯化工艺。一般地，SMB色谱技术应用于两组分分离系统。在制药工业中，作为结晶、选择性手性合成等拆分手性药物技术的取代技术。第34页，共42页，2023年，2月20日，星期三4.SMB色谱技术的优势（1）SMB色谱是一个连续色谱分离过程（2）SMB色谱技术比其他制备色谱的分离效率高（3）SMB色谱技术可以实现旋光异构物分离过程从分析型色谱条件快速、可靠的放大至生产规模（4）SMB色谱装置可以适合不同规模的色谱分离过程第35页，共42页，2023年，2月20日，星期三二、扩展床吸附色谱(expandedbedabsorption,EBA)1.EBA色谱的基本原理和特点使用特殊设计的扩张床介质在床层中适度膨胀，介质与介质间的空隙能让发酵液中的不吸附的固体颗粒直接穿过扩张床；同时，特殊设计的扩张床介质能够