第十四章 高效液相色谱法

第十四章高效液相色谱法第1页，共74页，2023年，2月20日，星期三学习大纲§14-1概述§14-2高效液相色谱仪§14-3液相色谱的固定相与流动相§14-4高效液相色谱的方法§14-5色谱分离方法的选择第十四章高效液相色谱法一、高效液相色谱法二、HPLC与经典LC区别三、HPLC与GC区别四、HPLC的特点和应用一、高压输液系统二、进样系统三、色谱柱四、检测器一、液相色谱固定相二、液相色谱的流动相一、分配色谱二、吸附色谱三、离子交换色谱四、离子色谱五、离子对色谱法六、尺寸排阻色谱法七、亲合色谱第2页，共74页，2023年，2月20日，星期三§14-1概述高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。一、高效液相色谱法早期液相色谱是在直径1~5cm,长50~500cm的玻璃柱中进行的。填充的固定相颗粒直径多在150~200µm范围内。但流速低(<1mL/min)，分析时间长；当加压增加流速时，尽管分析时间减少，但Hmin也相应增加了，柱效下降了。最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10µm）！直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。首页下一页末页退出第3页，共74页，2023年，2月20日，星期三H－dp关系图首页上一页下一页末页退出第4页，共74页，2023年，2月20日，星期三经典LCHPLC仅做为一种分离手段分离和分析柱内径1～3cm固定相粒径>100μm且不均匀柱内径2～6mm固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）常压输送流动相高压输送流动相柱效低（H↑，n↓）柱效高（H↓，n↑）无法在线检测可以在线检测分析周期长分析时间大大缩短二、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段首页上一页下一页末页退出第5页，共74页，2023年，2月20日，星期三三、HPLC与GC区别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测差别：分析对象的差别和流动相的差别1、分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性限制，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%首页上一页下一页末页退出第6页，共74页，2023年，2月20日，星期三2、流动相差别GC：流动相为惰性气体,组分与流动相无亲合作用力，只 与固定相作用。HPLC：流动相为液体，与组分间有亲合作用力，为提高柱 的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大 作用流动相种类较多，选择余地广，流动相极性和 pH值的选择也对分离起到重要作用。选用不同比例 的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选 择性。3、固定相差别液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余地大；而气相色谱的固定相有限。4、操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）；较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。根据实际情况也可采用控温方式，以提高分离速度。首页上一页下一页末页退出第7页，共74页，2023年，2月20日，星期三由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。第8页，共74页，2023年，2月20日，星期三四、HPLC的特点和应用“三高”、“一快”、“一广”高柱效——远高于一般LC高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广（可分析80%有机化合物）首页上一页末页退出第9页，共74页，2023年，2月20日，星期三分析应用食品添加剂残留“天然”化合物酸类化合物抗生素氨基酸抗氧化剂霉菌毒素酯类化合物防腐剂无机离子糖人工甜味剂农药维生素香料化合物无机离子色素首页上一页下一页末页退出第10页，共74页，2023年，2月20日，星期三HPLC仪器包括：1、高压输液装置

2、进样系统3、分离系统4、检测系统此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置HPLC工作过程示意图首页上一页下一页末页退出第11页，共74页，2023年，2月20日，星期三首页上一页下一页末页退出分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。第12页，共74页，2023年，2月20日，星期三一、高压输液系统（150～350×105Pa）

1、贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2µm，可防止颗粒物进入泵内。

2、脱气：流动相使用前必须进行脱气，以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较：

氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。

首页上一页下一页末页退出第13页，共74页，2023年，2月20日，星期三3、输液泵：输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。恒压泵：保持输出压力恒定，适于柱的匀浆填充。流量随外界阻力变化而变化，保留时间的重现性差，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。

恒流泵：能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。首页上一页下一页末页退出第14页，共74页，2023年，2月20日，星期三4、梯度洗脱装置：梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。

外梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度：一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。首页上一页下一页末页退出第15页，共74页，2023年，2月20日，星期三梯度洗脱类似GC中程序升温，梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。流动相A洗脱时，若样品中各成分容量因子Ｋ相差大，大的峰宽而低且分析时间长。流动相B溶解力强。洗脱时，各成分很快出来，则K(1.2)小的峰达不到分离。A→B若将A、B流动相的组成随时间改变，则即分离好，又缩短分析时间。首页上一页下一页末页退出第16页，共74页，2023年，2月20日，星期三在进行梯度洗脱时必须充分重视：①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。首页上一页下一页末页退出第17页，共74页，2023年，2月20日，星期三二、进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。

1、隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2、高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好。首页上一页下一页末页退出第18页，共74页，2023年，2月20日，星期三进样系统高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。第19页，共74页，2023年，2月20日，星期三三、色谱柱1、对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为10~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)2、柱的填充：主要采用匀浆法。平衡密度法：使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。首页上一页下一页末页退出第20页，共74页，2023年，2月20日，星期三检测器

检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。第21页，共74页，2023年，2月20日，星期三四、检测器1、紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10µL。HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。首页上一页下一页末页退出第22页，共74页，2023年，2月20日，星期三二极管阵列（PDA）检测器首页上一页下一页末页退出第23页，共74页，2023年，2月20日，星期三首页上一页下一页末页退出第24页，共74页，2023年，2月20日，星期三原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束光（通常是通过样品+溶剂相）因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。2、荧光检测器许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。3、示差折光检测器为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。首页上一页下一页末页退出第25页，共74页，2023年，2月20日，星期三4、安培检测器由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5µL）组成。该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学惰性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。首页上一页下一页末页退出第26页，共74页，2023年，2月20日，星期三5、电导检测器电导检测器主要用于离子色谱的检测。其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH>7时，该检测器不够灵敏。6、其它检测器MSIREvaporativelightscatteringdetector(光散射)极谱首页上一页下一页末页退出第27页，共74页，2023年，2月20日，星期三检测器性能指标（1）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线1小时，基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速和溶剂的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。

（2）灵敏度(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小，单位为mV·ml/g。对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为mV·s/g。（3）检测限(detectionlimit)：指恰好产生可辨别的信号时进入检测器的某组分的量。又称为敏感度(detectability)。D＝3N/S，式中N为噪声，S为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限的大小。检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。首页上一页下一页末页退出第28页，共74页，2023年，2月20日，星期三（4）线性范围(linearrange)：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些，能同时测定主成分和痕量成分。（5）池体积：除制备色谱外，大多数HPLC检测器的池体积都小于10µl。在使用细管径柱时，池体积应减少到1~2µl甚至更低，不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重。而且这时池体、检测器与色谱柱的连接、接头等都要精心设计，否则会严重影响柱效和灵敏度。首页上一页末页退出第29页，共74页，2023年，2月20日，星期三§14-3液相色谱的固定相与流动相一、液相色谱固定相stationaryphasesofLC1、液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；首页下一页末页退出第30页，共74页，2023年，2月20日，星期三（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N首页上一页下一页末页退出第31页，共74页，2023年，2月20日，星期三化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（4）有利于梯度洗脱；（5）存在着双重分离机制（键合基团的覆盖率决定分离机理）高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；首页上一页下一页末页退出第32页，共74页，2023年，2月20日，星期三2、离子交换色谱分离固定相结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂

薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相

薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）首页上一页下一页末页退出第33页，共74页，2023年，2月20日，星期三3、空间排阻分离固定相（1）软质凝胶

葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶

苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂。（3）硬质凝胶

多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。4、液-固吸附分离固定相种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；首页上一页下一页末页退出第34页，共74页，2023年，2月20日，星期三二、液相色谱的流动相mobilephasesofLC1、流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2、流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。首页上一页下一页末页退出第35页，共74页，2023年，2月20日，星期三3、流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)首页上一页下一页末页退出第36页，共74页，2023年，2月20日，星期三4、选择流动相时应注意的几个问题（1）高效液相色谱灵敏度高，尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。不纯的溶剂还会引起基线不稳，或产生“伪峰”。（2）化学稳定性好，避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，它严重干扰组分的吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。（5）低粘度（粘度适中）

若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。首页上一页末页退出第37页，共74页，2023年，2月20日，星期三§14-4高效液相色谱的方法

按分离原理可将HPLC分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。一、分配色谱1、原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。2、流动相:HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。首页下一页末页退出第38页，共74页，2023年，2月20日，星期三液液色谱固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为30~40m的实心玻璃球和厚度约为1~2m的多孔性外层所组成。（2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30~50m的多孔型颗粒。（3）全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为5~10m。由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。第39页，共74页，2023年，2月20日，星期三由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可因此常用的只有几种，按极性由高到低为：β,β’-氧二丙腈、聚乙二醇、三甲撑二醇、十八烷、角鲨烷。根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。3、固定液（1）机械涂渍固定相：

将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。

为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物首页上一页下一页末页退出第40页，共74页，2023年，2月20日，星期三（2）化学键合固定相Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。首页上一页下一页末页退出第41页，共74页，2023年，2月20日，星期三液—固色谱法

固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离。吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附，呈现高的保留值。吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。第42页，共74页，2023年，2月20日，星期三液—固色谱法固定相采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。第43页，共74页，2023年，2月20日，星期三液—固色谱法流动相必须符合下列要求：（1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。（2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。（3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。（4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。（5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值范围很广则使用梯度洗脱。第44页，共74页，2023年，2月20日，星期三化学键合相色谱法化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为四种键型：（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（=Si-O-C=）键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。（2）硅氮型（=Si-N=）键合相如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。（3）硅碳型（=Si-C=）键合相将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。（4）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。第45页，共74页，2023年，2月20日，星期三化学键合相色谱法正相键合色谱法将固定液的官能团键合在载体的表面，而构成化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法（BPC）。该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。（1）分离机制：

分配过程：组分在两相间进行分配，极性强的组分分配系数大

吸附过程：溶质分子与固定相之间定向作用力（诱导力、或氢键作用力）（2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相（3）流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇首页上一页下一页末页退出第46页，共74页，2023年，2月20日，星期三（4）流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓（5）出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱。（6）适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似。氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性，分析极性大物质、糖类等。首页上一页下一页末页退出第47页，共74页，2023年，2月20日，星期三反相键合相色谱（1）分离机制：疏溶剂理论

把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时：一方面非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。（2）固定相：极性小的烷基键合相

C8柱，C18柱（ODS柱）（3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性>固定相极性

底剂+有机调节剂（极性调节剂）

例：水+甲醇，乙腈，THF首页上一页下一页末页退出第48页，共74页，2023年，2月20日，星期三正相和反相键合色谱法正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k增加。在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，其目的都是为了防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。首页上一页下一页末页退出第49页，共74页，2023年，2月20日，星期三正、反相色谱中极性和保留时间的关系首页上一页下一页末页退出第50页，共74页，2023年，2月20日，星期三可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长（极性越小），分离效果越好。首页上一页下一页末页退出第51页，共74页，2023年，2月20日，星期三首页上一页下一页末页退出第52页，共74页，2023年，2月20日，星期三

第53页，共74页，2023年，2月20日，星期三化学键合色谱具有下列优点：（1）适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。（2）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。（3）键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。（4）固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。第54页，共74页，2023年，2月20日，星期三离子交换色谱此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。1、原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：对阳离子，滞留时间从大到小的顺序为：Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+

对阴离子，滞留时间从大到小的顺序为：柠檬酸根,SO42-,C2O42-,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-

首页上一页下一页末页退出第55页，共74页，2023年，2月20日，星期三一般形式：R一A＋B＝R－B＋A达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：式中[A]r，[B]r分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表它们在溶液中的浓度。KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。第56页，共74页，2023年，2月20日，星期三2、固定相按离子交换剂类型分四种：按固定相制作方法可分为：多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；离子交换键合型。首页上一页下一页末页退出第57页，共74页，2023年，2月20日，星期三（1）多孔型聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多——交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。（2）表面多孔型薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2µm)多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。首页上一页下一页末页退出第58页，共74页，2023年，2月20日，星期三（3）离子交换键合相利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。

3、流动相

离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度)，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。

pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。

首页上一页下一页末页退出第59页，共74页，2023年，2月20日，星期三无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质均显示不同pH值影响结果，因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。首页上一页下一页末页退出第60页，共74页，2023年，2月20日，星期三首页上一页下一页末页退出第61页，共74页，2023年，2月20日，星期三离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对-R+或-R-的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量L和组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+X⇐⇒RM-X+L。该法用于分离各种氨基酸或碱类。首页上一页下一页末页退出第62页，共74页，2023年，2月20日，星期三四、离子色谱离子色谱(IC)是70年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。为解决此问题，1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：R+—OH+HCl(流动相)——R+—Cl-+H2OR+—OH+MCl(待测物)——R+—Cl+M+OH-可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。首页上一页下一页末页退出第63页，共74页，2023年，2月20日，星期三由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2．6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。第64页，共74页，2023年，2月20日，星期三优点：（1）分析速度快可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱首页上一页下一页末页退出第65页，共74页，2023年，2月20日，星期三该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度