大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立

11文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑，有帮助欢迎下载支持.大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立【摘要】目的应用Matrigel建立大鼠视网膜微血管内皮细胞(RetinalMicrovascularEndothelialCells,RMECs)血管形成的体外培养体系，为进一步探讨视网膜相关疾病提供实验基础。方法体外培养RMECs，在Matrigel上建立血管形成的体外培养体系。结果经分离培养的RMECs在Matrigel上培养形成管腔样结构。结论RMECs能够在Matrigel上形成血管腔。【关键词】视网膜微血管内皮细胞;细胞培养;血管形成Abstract:ObjectiveToinduceRatRetinalMicrovascularEndothelialCells(RMECs)toFormNewBloodVesselsbysettingupastableangiogenesisculturesystemonMatrigel.Itwouldbeabasicexperimentalstudyfortheretinal-relateddisease.MethodsByculturingRMECsinvitroandsettingupastableangiogenesisculturesystemonMatrigel.ResultsRMECswereluminaformationonMatrigel.ConclusionsRMECscanbeinducedtoformmewbloodvesselsonMatrigelinvitro.Keywords:RetinalMicrovascular，EndothelialCells;cellculture;angiogenesis血管内皮细胞密切参与糖尿病微血管病变和肿瘤血管新生等病理过程［1,2］。视网膜微血管内皮细胞(RetinalMicrovascularEndothelialcells,RMECs)能合成和分泌多种物质，是糖尿病微血管文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑，有帮助欢迎下载支持.病中各种生理、病理因素作用的靶细胞［3］。本实验在体外培养RMECs，应用Matrigel建立血管形成的体外培养体系，为进一步探讨视网膜相关疾病提供实验基础。材料与试剂实验动物SD大鼠，体重100〜1508，中国医科大学实验动物部。试剂DMEM培养基（Sigma）、胎牛血清（天津灏洋）、II型胶原酶（Gibco）、胰酶（81。$卜@5）、内皮细胞生长添加物（ECGS、实验室自制）、肝素钠（上海精析）、Percol液（天津灏洋）、明胶（Sigma）、Matrigel（BectonDickison）、兔加因子相关抗原多克隆抗体（santacruz）。实验方法原代细胞分离培养参照文献［4,5］并加以改善进行细胞分离培养。①分离视网膜微血管段：SD大鼠过量乙醚处死，完整摘除眼球，70%乙醇浸泡30s,沿角膜缘剪开，去除晶状体和角膜，分离出视网膜组织，除去可见的主枝大血管，于PBS中简单漂洗、剪碎。将剪碎的视网膜组织首先经过80目尼龙筛网滤过，收集网下液;再经过200目筛网，收集网上液后2500r/min离心12min,弃上清，得到视网膜微血管段。②视网膜微血管段的消化和培养：加入5〜10倍体积的0.1%II型胶原酶消化,37℃振荡水浴30〜50min,吹打10min;离心，沉淀物用DMEM清洗2次，将视网膜微血管段置于事先用0.5%明胶铺过的培养瓶内，加入适量的DMEM培养基（含20%胎牛血清、ECGS文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑，有帮助欢迎下载支持.400Hg/mL、肝素钠200Hg/mL、青霉素100U/mL、链霉素100ug/mL),37℃、5%CO2孵育箱培养。每日倒置相差显微镜下进行形态学观察。传代细胞培养48h后第1次换液清除未贴壁的细胞，以后隔日换液。原代细胞长至亚融合即可传代，以0.125%胰酶(含0.01%EDTA)消化细胞，倒置相差显微镜下观察，细胞收缩变圆，即终止消化，吹打制成细胞悬液，按1:2〜3接种。RMECs的鉴定崔丹，等：大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立辽宁医学院学报2009年10月，30(5)2.3.1形态学观察用倒置相差显微镜直接观察细胞的生长过程及形态特点，并拍照记录。2.3.2免疫荧光法检测第加因子相关抗原将培养的细胞接种于铺有盖玻片的24孔板中，细胞用4%多聚甲醛固定10min，PBS洗后，滴加0.1%Triton-100“打孔”，室温10min;PBS洗;5%BSA封闭10min,弃去不洗，滴一抗(1：300),4℃孵育过夜;PBS洗，滴加荧光标记羊抗兔二抗(1：100),室温1h,PBS洗，90%甘油封片。荧光显微镜观察。Matrigel上诱导血管形成Matrigel冻存于-