实验二醋酸纤维素薄膜电泳

山东医学高等专科学校《生物化学》实验教案教研室生物化学课程生物化学实验专业09级所有专业指导教师徐燕教材生物化学实验指导内容实验一醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质学时2教学要求学的要教目和求1.掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术2.测定血清中各种蛋白质的相对含量教学重点难点重点：醋酸纤维素薄膜分离血清蛋白质的方法难点：电泳的基本原理和主要影响因素教学媒体学生动手操作为主，课堂演示为辅复习旧课蛋白质的两性解离性质教学过程讲授新课原理乙酸纤维素薄膜电泳是以乙酸纤维素薄膜作为支持体的一种电泳方法。本实验将其用于分离血清蛋白质。方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6,血清蛋白质在此缓冲液中带有负电荷，在电场中移向正极，血清中不同蛋白质由于带有电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快，带电荷少及分子量大者泳运速度慢。经过一定的时间后，取消电薄取出，立即将其浸入氨基黑10B染色液中，使蛋白质固定并染色。随后将薄膜移入浸洗液中，洗至背景无色为止+此时薄膜上显示出蓝色区带，每条带代表一种蛋白质，按泳动快慢顺序，各区带分别为清蛋白、al-球蛋白、a2-球蛋白、0-球蛋白和Y-球蛋白。乙酸纤维素薄膜由于对样品没有吸附现象，电泳时各区带分界清楚，拖尾现象不明显，样品用量少，以及电泳时间短等，已被广泛应用。试剂和器材1.试剂新鲜血清(无溶血现象)巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6)称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于少量蒸馏水后定容1000ml。漂洗液取95%乙醇45ml，冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混匀。

（4）洗脱液0.4mol/NaOH。2.器材电泳仪、电泳槽、乙酸纤维素薄膜、盖玻片、滤纸、剪刀（三）操作方法乙酸纤维素薄膜的润湿和选择讲授新课将2.0cmx8.0cm薄膜放入缓冲液中浸泡10min,整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀（讲授新课制作电桥将巴比妥缓冲液倒入电泳槽内，用乳胶管连通两槽，使两槽缓冲液平衡至同一水平面。取去乳胶管，于两电极槽各放入四层滤纸或纱布，一端浸入缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架上，它们的作用是联系薄膜与两极缓冲液之间的中间“桥梁”。点样与电泳取出浸透的薄膜，平放在滤纸上（无光面向上），轻轻吸去多余的缓冲液。用点样器蘸取血清，“印”在薄膜的点样区，点样区要呈粗细均匀一直线。将点好样的薄膜两端紧贴在电泳槽支架的滤纸桥上，点样端置负极，平衡10min，接通电源，调节电流为0.4〜0.6mA（薄膜每厘米宽），电压为每厘米长10—12V，电泳45--60min。染色与浸洗电泳完毕后，切断电源，将薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，15min后取出。然后用漂洗液浸洗3遍，每次约10min，直至背景无色为止。结果判断一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、al-球蛋白、a2-球蛋白、0-球蛋白和Y-球蛋白。（四）注意事项乙酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为这小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。

讲授新课电泳槽中缓冲液要保持清洁（数天过滤一次），两极溶液要交替使用，最好将连接正、负极的线路调换使用。通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。课堂提问醋酸纤维素薄膜电泳的原理及优点课堂小节根据血清中蛋白质各组分等电点，如何估计它们在