第三部分有机介质中的酶反应

第三部分有机介质中的酶反应第1页，共109页，2023年，2月20日，星期三第一节有机介质中的酶促反应概述一．有机相酶反应的优点：二．有机相酶反应具备条件三．有机相酶反应的研究进展四．有机相酶反应的应用现状第2页，共109页，2023年，2月20日，星期三一．有机相酶反应的优点：1．有利于疏水性底物的反应。2．可提高酶的热稳定性.3．能催化在水中不能进行的反应4．可改变反应平衡移动方向5．可控制底物专一性第3页，共109页，2023年，2月20日，星期三一．有机相酶反应的优点：6．可防止由水引起的副反应。7．可扩大反应pH值的适应性。8．酶易于实现固定化。9．酶和产物易于回收。10．可避免微生物污染。第4页，共109页，2023年，2月20日，星期三二．有机相酶反应具备条件1．保证必需水含量。2．选择合适的酶及酶形式。3．选择合适的溶剂及反应体系。4．选择最佳pH值。第5页，共109页，2023年，2月20日，星期三三．有机相酶反应的研究进展1．超临界流体中的酶反应2．仿水溶剂和印迹技术第6页，共109页，2023年，2月20日，星期三1．超临界流体中的酶反应超临界流体的概念:指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。第7页，共109页，2023年，2月20日，星期三超临界流体的有关性质（1）超临界流体的P-V-T性质流体名称乙烷丙烷丁烷戊烷乙烯氨CO2二氧化硫水临界温度（℃）32.396.9150.0296.79.9132.431.1157.6374.3临界压力（Mpa）4.263.83.385.1211.287.387.8822.114.88临界密度(g/cm3)0.2200.2280.2320.2270.2360.4600.5250.3260.203第8页，共109页，2023年，2月20日，星期三超临界流体的有关性质（2）所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1℃，临界压力7.28Mpa)时的状态。该流体具有无毒、无臭、不燃等优点。第9页，共109页，2023年，2月20日，星期三超临界流体的有关性质（3）提高溶剂选择性的基本原则是：第一：操作温度和超临界流体的临界温度接近；第二：超临界流体的化学选择和待分离溶质的化学性质接近。第10页，共109页，2023年，2月20日，星期三超临界流体萃取的应用实例工业类别应用实例医药工业（1）原料药的浓缩，精制和脱溶剂（抗生素等）（2）酵母，菌体生成物的萃取（r-亚麻酸，酒精等）（3）酶，维生素等的精制，回收（4）从动植物中萃取有效药物成分（生物碱，维生素E，芳相油等）（5）脂质混合物的分离精制（甘油酯，脂肪酸，卵磷酯）食品工业（1）植物油的萃取（大豆，棕榈，花生，咖啡）（2）动物油的萃取（鱼油，肝油）（3）食品的脱脂（马铃薯片，无脂淀粉，油炸食品）（4）从茶，咖啡中脱除咖啡因，啤酒花的萃取（5）香料的萃取（6）植物色素的萃取（7）油脂的脱色脱臭化妆品香料工业（1）天然香料的萃取，合成香料的分离，精制，（2）烟草脱烟碱（3）化妆品原料的萃取，精制（界面活性剂，单甘酯等）第11页，共109页，2023年，2月20日，星期三2．仿水溶剂和印迹技术（1）仿水溶剂体系（2）分子印迹技术第12页，共109页，2023年，2月20日，星期三（1）仿水溶剂体系原理:可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。第13页，共109页，2023年，2月20日，星期三极性添加剂对体系的影响a.对反应体系内水的分配影响b.与蛋白质的直接作用c.对产物分配的影响第14页，共109页，2023年，2月20日，星期三应用举例：通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。第15页，共109页，2023年，2月20日，星期三（2）分子印迹技术e.g.1当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。第16页，共109页，2023年，2月20日，星期三分子印迹技术原理：竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。第17页，共109页，2023年，2月20日，星期三第一节结束优点具备条件研究进展应用现状有利于疏水性底物的反应可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应能催化在水中不能进行的反应可改变反应平衡移动方向可控制底物专一性可防止由水引起的副反应可扩大反应pH值的适应性酶易于实现固定化酶和产物易于回收可避免微生物污染保证必需水含量合适的酶及酶形式合适的溶剂及反应体系最佳pH值超临界流体中的酶反应仿水溶剂和印迹技术第18页，共109页，2023年，2月20日，星期三第一节结束点击返回第19页，共109页，2023年，2月20日，星期三第二节有机介质中酶促反应的条件一．必需水二．酶的选择三．溶剂及反应体系的选择四．pH选择和离子强度的影响第20页，共109页，2023年，2月20日，星期三一．必需水概念：紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。第21页，共109页，2023年，2月20日，星期三一．必需水

第22页，共109页，2023年，2月20日，星期三2．干燥的酶水合过程：（1）与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）（2）与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)（3）凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.25~0.38g/g）（4）酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。第23页，共109页，2023年，2月20日，星期三3．影响酶反应体系中需水含的因素a．不同酶需水量不同b.同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同溶剂疏水性越强，需水量越少第24页，共109页，2023年，2月20日，星期三胰脂肪酶活性与含水量的关系第25页，共109页，2023年，2月20日，星期三4．表征必需水作用的参数---热力学水活度即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与相同条件下纯水的蒸气压之比。该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。第26页，共109页，2023年，2月20日，星期三二酶的选择1酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶，过氧化物酶等。除与酶有关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关。第27页，共109页，2023年，2月20日，星期三2．酶形式的选择（1）酶粉：例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。第28页，共109页，2023年，2月20日，星期三二．酶的选择（２）化学修饰酶：例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、PH、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。第29页，共109页，2023年，2月20日，星期三二．酶的选择（３）固定化酶：把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。第30页，共109页，2023年，2月20日，星期三二．酶的选择（３）固定化酶：第31页，共109页，2023年，2月20日，星期三有机相中固定化后载体对酶的影响A.载体能通过分配效应剧烈地改变酶微环境中底物和产物的局部浓度。第32页，共109页，2023年，2月20日，星期三B.载体影响酶分子上的结合水通过选择合适的载体可使体系中的水进行有利分配。第33页，共109页，2023年，2月20日，星期三C.通过载体与酶之间形成的多点结合作用，可稳定酶的催化活性构象。例：α-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合后，在乙醇中的稳定性明显提高，并且对有机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的增加而增强。第34页，共109页，2023年，2月20日，星期三D.酶动力学影响一个酶同时催化的两个反应的相对速度。例在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺载体上，水解反应被抑制却有利于醇解反应。第35页，共109页，2023年，2月20日，星期三三．溶剂及反应体系的选择水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等第36页，共109页，2023年，2月20日，星期三1．酶促反应有机介质体系（1）单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂）（２）两相体系（水/水不溶性有机溶剂）（３）低水有机溶剂体系（有机溶剂体系）（４）反胶束体系☆第37页，共109页，2023年，2月20日，星期三A.反胶束体系概念反胶束体系：是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。第38页，共109页，2023年，2月20日，星期三概念表面活性剂表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。第39页，共109页，2023年，2月20日，星期三概念临胶束浓度临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示。CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定。第40页，共109页，2023年，2月20日，星期三第41页，共109页，2023年，2月20日，星期三概念正常微团：极性头部向外，与水结合；疏水尾部向内，形成一个非极性的核心。反向微团：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核。第42页，共109页，2023年，2月20日，星期三B.反胶束体系的制备将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。第43页，共109页，2023年，2月20日，星期三反胶束体系的制备第44页，共109页，2023年，2月20日，星期三影响因素反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而变化，同时也受温度、压力、离子强度的影响。第45页，共109页，2023年，2月20日，星期三反胶束体系中的含水量反胶束的大小取决于反胶束的含水量Wo。Wo的定义为反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。第46页，共109页，2023年，2月20日，星期三C．基本原理：“水壳”模型反胶束系统中的水通常可分为结合水和自由水。结合水是指位于反胶束内部形成水池的那部分水；自由水即为存在于水相中的那部分水。第47页，共109页，2023年，2月20日，星期三“水壳”模型水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况，其间接证据较多。1.从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子的水层。2.α-糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在主体水中的特性很相象。3.反胶束中酶显示的动力学特性接近于在主体水中的特性。第48页，共109页，2023年，2月20日，星期三D．影响的主要因素水相pH值的影响离子强度的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定表面活性剂浓度的影响离子种类对萃取的影响第49页，共109页，2023年，2月20日，星期三构建双水相体系实现在线产物分离TopphaseBottomphase

SubstratesProductProductSideproduct

BiocatalystAquousTwoPhaseSystem--ATPS第50页，共109页，2023年，2月20日，星期三双水相体系将头孢立新得率提高3倍BiochemicalEngineeringJournal,2002,11(2-3):95-100.

J.MicrobiologyandBiotechnology,2004,14(1):62-67.

第51页，共109页，2023年，2月20日，星期三双相体系与水相体系中产物纯度的比较双相体系中，由于乙酸丁酯对产物苯乙酸的萃取，促进了酶反应的平衡，使得L-型底物的转化率为99.95％，而这样得到的D-叔亮氨酸的纯度也提高到99.5％。第52页，共109页，2023年，2月20日，星期三2．有机溶剂影响酶催化的方式（1）有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活A增大酶反应的活化能来降低酶反应速度B降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降。C酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。第53页，共109页，2023年，2月20日，星期三2．有机溶剂影响酶催化的方式（2）有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活3）有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用。第54页，共109页，2023年，2月20日，星期三3．选择有机溶剂必须考虑因素(1).有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。)第55页，共109页，2023年，2月20日，星期三相容性例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）第56页，共109页，2023年，2月20日，星期三(2).溶剂必须对于该主反应是惰性的制剂。例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。第57页，共109页，2023年，2月20日，星期三(3)必须考虑的其他因素溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）溶剂参数lgP：即一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。第58页，共109页，2023年，2月20日，星期三生物催化剂的环境调控技术通过“环境调控”技术，实现生物催化剂活性、选择性的人为控制

生物催化剂环境的改变：

会导致酶的结构构象的改变

进而酶的活性、选择性改变第59页，共109页，2023年，2月20日，星期三四．PH选择和离子强度的影响（1）pH选择：在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。第60页，共109页，2023年，2月20日，星期三氧化葡萄糖杆菌催化制备二羟基丙酮(DHA)二羟基丙酮(DHA)广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一个重要的化学合成中间体。工业上利用二羟基丙酮做为中间体的代表性的示例（资料来源MerckKGaA,Darmstadt,Germany)。第61页，共109页，2023年，2月20日，星期三环境pH的改变导致酶的选择性的改变Tetrahedron:Asymmetry,2004,15(8):1275-1277.

氧化葡萄糖杆菌催化D－乳酸转化第62页，共109页，2023年，2月20日，星期三山梨醇改变水活度改变底物的离子化程度头孢氨苄合成中助溶剂的影响

第63页，共109页，2023年，2月20日，星期三（2）离子强度影响随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大。第64页，共109页，2023年，2月20日，星期三第二节结束必需水酶的选择溶剂及反应体系pH选择和离子强度反胶束体系☆

酶种类的选择酶形式的选择概念正常微团反向微团“水壳”模型第65页，共109页，2023年，2月20日，星期三第二节结束点击返回第66页，共109页，2023年，2月20日，星期三第三节有机介质对酶性质的影响一、稳定性二、活性三、专一性四、反应平衡方向第67页，共109页，2023年，2月20日，星期三一、稳定性（１）热稳定性提高（２）储存稳定性提高第68页，共109页，2023年，2月20日，星期三一、稳定性第69页，共109页，2023年，2月20日，星期三结论在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。第70页，共109页，2023年，2月20日，星期三二活性刚-柔并存刚性：生物大分子结构的精确性柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。第71页，共109页，2023年，2月20日，星期三苯乙酸复合物模型中活性位点示意图图1.5苯乙酸复合物模型中活性位点示意图Scheme1.5Environmentoftheactivesiteinthephenylaceticacidcomplex.（Jing,H.J.Mol.Catal.B-Enzym.,2000,(11):45-53.）Thephenylaceticacidligandisshownasaballandstickrepresentation,withtheimportantresiduesinthebindingsitehighlightedasliquorice.Themeshrepresentsasolvent-accessibilitysurfacefortheproteincalculatedusinga1-radiusprobe.第72页，共109页，2023年，2月20日，星期三PGSO结合活性位点的电子云密度图图1.6PGSO结合活性位点的电子云密度图Scheme1.6StereoviewoftheelectrondensitymapofPGSOboundintheactivesiteofWT-PGSO.

（Ren,L.G.J.Mol.Catal.B-Enzym.,2002,(18):3-11）第73页，共109页，2023年，2月20日，星期三酶活性丧失的可能原因：第74页，共109页，2023年，2月20日，星期三二、活性1、单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响（1）有机溶剂直接作用于酶（2）有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。第75页，共109页，2023年，2月20日，星期三2、低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化例：有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水浓度下的酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一定水活度下，酶活性随载体不同而变化

第76页，共109页，2023年，2月20日，星期三3、在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引起。第77页，共109页，2023年，2月20日，星期三根据：（1）微团水化程度（W）（W=[H2O]/[表面活性剂]）的最佳值和酶活性的最大值呈正相关（２）W值最佳时，微团内径总是相当于被包裹的酶分子直径。第78页，共109页，2023年，2月20日，星期三超活性产生机理第79页，共109页，2023年，2月20日，星期三三、专一性某一些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。第80页，共109页，2023年，2月20日，星期三四、反应平衡方向酶合成产物有机溶剂使用浓度（%）合成收率（%）枯草杆菌蛋白酶核糖核酸酶甘油9050无色杆菌蛋白酶人胰岛素DMF和乙醇3080羧肽酶牛胰核糖核酸酶甘油9050凝血酶人生长激素甘油8020嗜热杆菌蛋白酶天冬甜味素乙酸乙酯

胰凝乳蛋白酶脑啡肽乙醇或DMF

第81页，共109页，2023年，2月20日，星期三第三节结束稳定性活性☆专一性反应平衡方向热稳定性提高储存稳定性提高第82页，共109页，2023年，2月20日，星期三第三节结束点击返回第83页，共109页，2023年，2月20日，星期三第四节有机介质中酶催化的应用酶 催化反应 应用蛋白酶 肽合成 合成多肽 酰基化 糖类酰基化 羟基化酶 氧化 甾体转化过氧化物酶 聚合 酚类、胺类化合物的聚合胆固醇氧化酶 氧化 胆固醇测定醇脱氢酶 酯化 有机硅醇的酯化第84页，共109页，2023年，2月20日，星期三有机介质中酶催化的应用酶 催化反应 应用脂肪酶 肽合成 青霉素G前体肽合成 酯合成 醇与有机酸合成酯类 转酯 各类酯类生产 聚合 二酯的选择性聚合 酰基化 甘醇的酰基化第85页，共109页，2023年，2月20日，星期三有机介质中酶催化的应用手性药物的拆分手性高分子聚合物的制备酚树脂的合成导电有机聚合物的合成发光有机聚合物的合成第86页，共109页，2023年，2月20日，星期三有机介质中酶催化的应用食品添加剂的生产多肽的合成甾体转化生物能源第87页，共109页，2023年，2月20日，星期三一．手性药物的拆分概念：手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物第88页，共109页，2023年，2月20日，星期三1手性药物两种对映体的药效差异一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效一种有显著疗效，另一种有毒副作用两种对映体的药效相反两种对映体具有各自不同的药效两种消旋体的作用具有互补性第89页，共109页，2023年，2月20日，星期三2．手性药物的拆分方法分为：非生物法、生物法非生物法（机械分离法、形成和分离对映体异构法、色谱分离法、动力学拆分）第90页，共109页，2023年，2月20日，星期三生物拆分法原理实质即两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择性，从而使反应产物具有光学活性。第91页，共109页，2023年，2月20日，星期三生物拆分法快：E+A→E+P慢：E+B→E+Q对映体选择率：底物中一对异构体（同一个酶的两种竞争性底物）的Vm/Km之比为酶的选择性。第92页，共109页，2023年，2月20日，星期三生物拆分法E:反映某一拆分过程的效果，也表征酶选择性的大小，是酶反应的特征参数。光学纯度op.(%)=[a]/[a]纯品第93页，共109页，2023年，2月20日，星期三对映体过量值，残余底物:生成底物:一般认为比旋光度与组成之间成直线关系，因此在实验无误差时，o.p与ee所表示的数值应是相同的。生物拆分法第94页，共109页，2023年，2月20日，星期三青霉素酰化酶及其催化作用利用其底物专一性及对映体的选择性进行光学异构体的合成与拆分。TWWang,DZWei*etal.,Structure-BasedStabilizationofanEnzyme:TheCaseofPenicillinAcylasefromAlcaligenesfaecalis,Protein&PeptideLetters,2006(Inpress).第95页，共109页，2023年，2月20日，星期三Shu-LaiLiu，DongzhiWei*,etal.,BioprocessandBiosystemsEngineering,2006(Inpress).Shu-LaiLiu，DongzhiWei*,etal.,PreparativeBiochemistry&Biotechnology,2006(Inpress).青霉素酰化酶催化叔亮氨酸拆分第96页，共109页，2023年，2月20日，星期三