细胞生物学章沈婷

第三章

细胞生物学研究方法目前一页\总数一百一十八页\编于二十一点

研究方法和手段的不断创新推动着科学的发展，每当有一种新的重大技术突破时，即预示着科学将又一次飞跃，所以研究方法是非常重要的。当今细胞生物学中使用的方法多种多样，但总地来说，可划分为四大类：细胞形态观察的方法（显微技术）、细胞组分分析与原位检测技术、细胞培养与细胞工程技术和分子生物学技术等。为什么学习研究方法？目前二页\总数一百一十八页\编于二十一点细胞生物学研究方法第一节：常用模式生物第二节：细胞形态结构的观察方法第三节：组分分析第四节：细胞培养、细胞功能目前三页\总数一百一十八页\编于二十一点第一节、研究细胞生物学的模式生物:个体较小

易培养

操作简单

生长繁殖快目前四页\总数一百一十八页\编于二十一点病毒：生物大分子互作、基因表达调控、肿瘤的发生与防治

细菌：转基因、基因表达调控

酵母菌：细胞分裂周期调控、蛋白质互作等

线虫：1mm，959cell，3Day，发育生物学、遗传学、基因组学

果蝇：基因保守，与人类基因同源性高

斑马鱼：透明，个体发育与组织形态发生

小鼠：哺乳动物

拟南芥：植物遗传学几种模式生物目前五页\总数一百一十八页\编于二十一点CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana早在20世纪最初的20年中，人们就发现，如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发育的现象难题可以得到部分解答。因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察。由于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性，所以利用位于生物复杂性阶梯较低级位置上的物种来研究发育共通规律是可能的。尤其是当在有不同发育特点的生物中发现共同形态形成和变化特征时，发育的普遍原理也就得以建立。因为对这些生物的研究具有帮助我们理解生命世界一般规律的意义，所以它们被称为“模式生物”。目前六页\总数一百一十八页\编于二十一点第二节细胞形态结构的观察方法光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。扫描隧道显微镜目前七页\总数一百一十八页\编于二十一点（一）普通光学显微镜①照明系统1.构成：②光学放大系统③机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。目前八页\总数一百一十八页\编于二十一点目前九页\总数一百一十八页\编于二十一点目前十页\总数一百一十八页\编于二十一点普通复式光学显微镜技术显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。分辨率是指区分开两个质点间的最小距离n=介质折射率；α=镜口角（聚焦点对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numericapertuꛘҌ）。目前十一页\总数一百一十八页\编于二十一点3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。

•R=0.61λ/N．A．

–其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。•思考：如何提高显微镜的分辨能力？介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66几种介质的折射率目前十二页\总数一百一十八页\编于二十一点显微镜和显微镜的分辨能力肉眼：0.2mm;光镜：0.2um;电镜：0.2nm目前十三页\总数一百一十八页\编于二十一点（二）相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。原理目前十四页\总数一百一十八页\编于二十一点用途：观察未经染色的玻片标本目前十五页\总数一百一十八页\编于二十一点微分干涉差显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。目前十六页\总数一百一十八页\编于二十一点培养物中未经染色的的同一个动物细胞的三个图象。A.普通光学显微镜亮视野看到的。B.微分干涉显微镜。C.相差显微镜系统。目前十七页\总数一百一十八页\编于二十一点特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。特异蛋白质等生物大分子定性定位研究，标本需特异荧光染料，光源为短波光（三）荧光显微镜Fluorescencemicroscope目前十八页\总数一百一十八页\编于二十一点落射荧光显微镜的构造吸收滤色镜激发滤色镜分色镜汞灯紫外线保护罩孔径光栏（FS）视场光栏（AS）目前十九页\总数一百一十八页\编于二十一点细胞内的天然物质如叶绿素，经紫外线照射后能发出可见荧光----自发荧光。细胞内某些成分用荧光染料进行染色，在荧光显微镜下也能观察到荧光----诱发荧光。目前二十页\总数一百一十八页\编于二十一点用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen目前二十一页\总数一百一十八页\编于二十一点荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）目前二十二页\总数一百一十八页\编于二十一点用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。（四）激光共聚焦扫描显微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM目前二十三页\总数一百一十八页\编于二十一点（四）激光扫描共焦显微镜技术

LaserScanningConfocalMircroscope在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机迸行图像处理，从而得内部微细结构的荧光图像目前二十四页\总数一百一十八页\编于二十一点laserconfocalscanningmicroscope,LCSM目前二十五页\总数一百一十八页\编于二十一点LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)目前二十六页\总数一百一十八页\编于二十一点荧光共振能量转移（FRET）技术（P55）是检测活体中生物大分子纳米距离和纳米距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。FRET现象：当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，称FRET现象。采用融合表达方式，可将两个蛋白的距离拉近于5～10nm。FRET效率反映了被检的两种蛋白是否直接作用及作用的强弱。目前二十七页\总数一百一十八页\编于二十一点荧光漂白恢复技术（P56）又称光脱色恢复技术，可用于检测活体细胞表达或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆的淬灭，光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。目前二十八页\总数一百一十八页\编于二十一点二、电子显微镜以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍用于观察超微结构（小于0.2µm）目前二十九页\总数一百一十八页\编于二十一点电子显微镜与光学显微镜基本区别

显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理光镜LM200nm可见光（400-700nm）紫外光（约200nm)玻璃透镜不要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化电镜TEM0.2nm电子束（0.01-0.9）电磁透镜真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差目前三十页\总数一百一十八页\编于二十一点不同光线的波长名称可见光紫外光X射线α射线电子束0.1Kv10Kv波长（nm）390~76013~3900.05~130.005~10.1230.0122目前三十一页\总数一百一十八页\编于二十一点（一）透射电子显微镜transmissionelectronmicroscope,TEM目前三十二页\总数一百一十八页\编于二十一点香烟过滤嘴纤维表面的烟雾粒子目前三十三页\总数一百一十八页\编于二十一点血液凝块构造（红色为红血球，兰色为血小板，黄色为纤维蛋白）。目前三十四页\总数一百一十八页\编于二十一点TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM目前三十五页\总数一百一十八页\编于二十一点放大200倍的斜纹藻

作者：迈克尔·斯特林格(MichaelStringer)

作品名称：《斜纹藻》(海洋硅藻)(200倍)

拍摄地点：英国艾塞克斯郡滨海韦斯特克利夫

所用技术：暗视野和偏振光

2009年世界显微大赛目前三十六页\总数一百一十八页\编于二十一点放大30倍碳纳米管

作者：保罗·马歇尔(PaulMarshall)

作品名称：碳纳米管(30倍)

工作单位：加拿大国家研究理事会

拍摄地点：加拿大安大略湖渥太华

所用技术：立体显微镜技术

2009年显微大赛目前三十七页\总数一百一十八页\编于二十一点作者：查尔斯·卡兹莱克(CharlesKazilek)

作品名称：日本专业纸纤维(100倍)

工作单位：亚利桑那州大学

拍摄技术：共焦2009年显微大赛放大100倍的专业纸纤维

目前三十八页\总数一百一十八页\编于二十一点2、制样技术1）超薄切片电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。目前三十九页\总数一百一十八页\编于二十一点目前四十页\总数一百一十八页\编于二十一点包埋的样品玻璃或金属刀片超薄切片条将切片条置于玻片上，染色、加盖玻片切片机的臂目前四十一页\总数一百一十八页\编于二十一点2）负染技术NegativeStainedActin用重金属盐（如磷钨酸）对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。目前四十二页\总数一百一十八页\编于二十一点3）冰冻蚀刻freeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。AYeastCell目前四十三页\总数一百一十八页\编于二十一点（二）扫描电子显微镜20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。目前四十四页\总数一百一十八页\编于二十一点Scanningelectronmicroscope（SEM）目前四十五页\总数一百一十八页\编于二十一点工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。目前四十六页\总数一百一十八页\编于二十一点扫描电子显微镜原理目前四十七页\总数一百一十八页\编于二十一点人类红细胞目前四十八页\总数一百一十八页\编于二十一点酵母酵母细胞目前四十九页\总数一百一十八页\编于二十一点原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。（三）扫描隧道显微镜scanningtunnelingmicroscope，STM目前五十页\总数一百一十八页\编于二十一点扫描隧道显微镜原理目前五十一页\总数一百一十八页\编于二十一点第三节细胞组分的分析方法目前五十二页\总数一百一十八页\编于二十一点一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。转速>25kr/min，离心力>89kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。目前五十三页\总数一百一十八页\编于二十一点•特点：–介质密度均一

–速度由低向高，逐级离心•用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。•沉降顺序：核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高基体—核蛋白体。•可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。（一）差速离心Differentialcentrifugation目前五十四页\总数一百一十八页\编于二十一点LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation目前五十五页\总数一百一十八页\编于二十一点用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：

1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；

2）PH中性或易调为中性；

3）浓度大时渗透压不大；

4）对细胞无毒。（二）密度梯度离心目前五十六页\总数一百一十八页\编于二十一点Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation目前五十七页\总数一百一十八页\编于二十一点二、细胞化学技术组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。1.物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。2.化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。（一）固定目前五十八页\总数一百一十八页\编于二十一点（二）显示方法1.金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2.Feulgen反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示脱氧核糖核酸。3.联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。目前五十九页\总数一百一十八页\编于二十一点4.

脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。四氧化锇+不饱和脂肪酸黑色（证明脂肪滴的存在）5.

米伦反应：用于蛋白质检测。氮汞试剂蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应，形成红色沉淀。6.

PAS反应：确定多糖的存在，其原理是利用希夫试剂与醛基之间的反应，这时的醛基来自过碘酸氧化多糖的1,2-乙二醇基，使醛基释放。目前六十页\总数一百一十八页\编于二十一点目前六十一页\总数一百一十八页\编于二十一点免疫荧光法（immunofluorescenttechnique）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。三、免疫细胞化学immunocytochemistry根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。目前六十二页\总数一百一十八页\编于二十一点四、显微光谱分析技术细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。目前六十三页\总数一百一十八页\编于二十一点目前六十四页\总数一百一十八页\编于二十一点五、放射自显影术•原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。•一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3HUDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。

–14C半衰期为5730年，3H为12.5年。用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等目前六十五页\总数一百一十八页\编于二十一点六、分子杂交技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。目前六十六页\总数一百一十八页\编于二十一点（一）原位杂交（insituhybridization）用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，后来又发明了免疫探针法。原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊的核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。目前六十七页\总数一百一十八页\编于二十一点（二）Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。目前六十八页\总数一百一十八页\编于二十一点目前六十九页\总数一百一十八页\编于二十一点七、流式细胞术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。目前七十页\总数一百一十八页\编于二十一点应用：1.分析细胞表面标志2.分析细胞内抗原物质3.分析细胞受体4.分析肿瘤细胞的DNA、RNA含量5.分析免疫细胞的功能目前七十一页\总数一百一十八页\编于二十一点目前七十二页\总数一百一十八页\编于二十一点原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。用途：活细胞分离，研究生命结构的表面性质，鉴定细胞或单细胞有机体的功能和病理状态、检测细胞生理状态和病理状态、分离不同种类的细胞，如分离哺乳动物的XY精子。八、细胞电泳目前七十三页\总数一百一十八页\编于二十一点第三节

细胞培养、细胞工程与显微操作技术第四节

细胞培养、细胞工程与显微操作技术目前七十四页\总数一百一十八页\编于二十一点一、细胞培养细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的试验技术。植物细胞培养为植物育种开辟了一条崭新的途径动物细胞培养为疫苗生产、药物研制与肿瘤防治等医学实践提供了全新的手段目前七十五页\总数一百一十八页\编于二十一点（一）动物细胞培养原代细胞培养：组织块，剪碎胰酶或胶原酶消化分散EDTA良好的营养液与无菌的培养环境（体温、PH）+小牛血清有利于细胞的贴壁与分裂目前七十六页\总数一百一十八页\编于二十一点牛血清的分类

根据牛出生时间和血清采制分离方法分为：1.胎牛血清：八月龄胎牛心脏穿刺取血；2.新生牛血清：出生12-24小时新生牛静脉采血；3.高级新生牛血清：采血后静置自然析出的血清；标准新生牛血清：经离心分离的血清；普通新生牛血清：融血或微融血的血清；

4.小牛血清：出生三月龄小牛动脉采血分离血清；目前七十七页\总数一百一十八页\编于二十一点原代培养（primaryculture）：即培养直接来自动物机体的细胞群;将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养（Passage）。细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。目前七十八页\总数一百一十八页\编于二十一点细胞系（cellline）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。目前七十九页\总数一百一十八页\编于二十一点下表实验室中常用的几种细胞细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞HenriettaLacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2／0骨髓瘤浆细小鼠CHO卵巢中国地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin1951目前八十页\总数一百一十八页\编于二十一点群体培养克隆培养目前八十一页\总数一百一十八页\编于二十一点Hela细胞CHO细胞目前八十二页\总数一百一十八页\编于二十一点（二）植物细胞培养1.外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。2.悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。目前八十三页\总数一百一十八页\编于二十一点4.单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株（DH群体）3.原生质体培养：培养脱壁后的细胞，一般为体细胞（2n）特点：

–①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；

–②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；

–③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。目前八十四页\总数一百一十八页\编于二十一点PlantCellCultureAnimalCellCulture目前八十五页\总数一百一十八页\编于二十一点二、细胞工程细胞工程是在细胞水平上的生物工程。1.细胞融合2.单克隆抗体技术3.细胞拆合与显微操作技术目前八十六页\总数一百一十八页\编于二十一点1.细胞融合细胞融合（cellfusion）或细胞杂交：通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。同核体：相同基因型的细胞融合而成。异核体：不同基因型的细胞融合而成。目前八十七页\总数一百一十八页\编于二十一点自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇,PEG）、物理方法（电击和激光）。目前八十八页\总数一百一十八页\编于二十一点细胞融合目前八十九页\总数一百一十八页\编于二十一点目前九十页\总数一百一十八页\编于二十一点（二）动物细胞融合1.过程：目前九十一页\总数一百一十八页\编于二十一点（二）动物细胞融合1.过程：灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞目前九十二页\总数一百一十八页\编于二十一点目前九十三页\总数一百一十八页\编于二十一点思考：1、什么叫动物细胞融合？2、促进细胞融合的方法有哪些?

3、细胞融合技术最大的优点是什么？4、植物体细胞杂交与动物细胞融合有哪些异同？物理法化学法生物法

电场法(效率高、伤害小、易操作)（离心、振动、电刺激）聚乙二醇（PEG）(一)动物细胞融合（细胞杂交）目前九十四页\总数一百一十八页\编于二十一点总结：比较植物体细胞杂交和动物细胞融合比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理融合前处理诱导方法用途细胞膜的流动性、植物细胞的全能性细胞膜的流动性用纤维素酶、果胶酶去壁用胰蛋白酶使细胞分散物理、化学方法物理、化学、生物方法获得部分或完整植株主要用于制备单克隆抗体目前九十五页\总数一百一十八页\编于二十一点2.单克隆抗体技术正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养；瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。英国人Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年的诺贝尔医学和生理学奖。目前九十六页\总数一百一十八页\编于二十一点既能分泌专一抗体、又具有无限增殖能力的细胞经过培养，得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。定义：目前九十七页\总数一百一十八页\编于二十一点1、抗体的传统生产方法该法制备抗体的特点：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。输入浆细胞动物体内

某抗体

某抗原思考与探究：如何获得大量化学性质单一、特异性强的抗体？再从动物血清中分离抗体目前九十八页\总数一百一十八页\编于二十一点一个B淋巴细胞——只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞——能无限增殖杂交瘤细胞1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒设想：目前九十九页\总数一百一十八页\编于二十一点1、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合?小鼠骨髓瘤细胞可以在体外培养条件下大量增殖，B淋巴细胞能够产生抗体，细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。2、骨髓瘤细胞是癌细胞吗?有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞，具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以说，瘤细胞不能等于癌细胞。目前一百页\总数一百一十八页\编于二十一点杂交细胞灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞经免疫的小鼠提取杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择性培养基第二次筛选能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体目前一百零一页\总数一百一十八页\编于二十一点目前一百零二页\总数一百一十八页\编于二十一点例题1：1975年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合”在一起，说明细胞膜

。(2)单克隆抗体的准确定义应为()A．一类特殊抗体B．无性繁殖系C．单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体

D．单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是_______分裂，其遗传性状__________。(4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”这是利用了_____________

。具有一定的流动性C有丝不变抗体能与抗原发生特异性结合的特点目前一百零三页\总数一百一十八页\编于二十一点

※知识拓展：如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？

融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。目前一百零四页\总数一百一十八页\编于二十一点单克隆抗体：特异性强、纯度高、灵敏度高，产量大、容易标准化生产。优点：可以用不纯的抗原分子制备纯化的单克隆抗体。原则上可以做出抗细胞中任何蛋白质的单克隆抗体，以此作为探针，确定核蛋白在细胞中的位置或用于纯化该种蛋白。3、单克隆抗体的优点目前一百零五页\总数一百一十八页\编于二十一点4、单克隆抗体的应用１、可用于作为诊断试剂：有准确，高效，简易、快速的优点２、可用于疾病治疗３、可用于运载药物（作为运载对应疾病的药物的“生物导弹”。）“生物导弹”＝单克隆抗体＋药物目前一百零六页\总数一百一十八页\编于二十一点总结一种诱导细胞融合的新方法一种新细胞灭活病毒杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势目前一百零七页\总数一百一十八页\编于二十一点[例题2]（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选)

（

）A．T淋巴细胞B．效应B淋巴细胞

C．抗体D．记忆细胞（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，正确的是(多选)